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干貨通道：一種助力腫瘤研究的新工具——外泌體-AAV

吉凱基因

2022.12.14

近年來外泌體的研究熱度持續攀升，吉凱基因已經助力老師們在腫瘤領域發表了多篇文獻[1,2]。那么外泌體是什么，又是如何助力老師們實驗的升華呢？外泌體是從活細胞釋放到細胞外微環境的50-150nm大小的囊泡，由于腫瘤來源的外泌體調節腫瘤的微環境并協助遠處轉移，所以，外泌體可以作為遞送基因的載體，通過瘤內注射或靜脈注射，起到抗腫瘤的效果。

同樣做遞送基因的載體，工具病毒也在抗腫瘤的“江湖中”占有一席之地。慢病毒轉導的T細胞進行體外基因治療[3]，在治療腫瘤方面具有顯著療效，但價格昂貴，且技術上也有挑戰性；而腺相關病毒（AAV）已被臨床實驗（遺傳性失明、脊髓性肌萎縮）證明，在體內實驗安全有效，那么AAV如何提高轉染免疫細胞的效率呢？我選擇了一篇技術干貨，幫助老師們理解。

作者將廣譜啟動子CBA和報告基因（GFP）構建到scAAV中，經過流式分析驗證：scAAV感染體內的免疫細胞是可行的。此外，為了觀察scAAV攜帶的基因在體內表達的動力學，作者將9E+11vg的exo-scAAV8，尾靜脈注入小鼠體內，并在注射后的3天、7天、14天、21天、28天從小鼠血液中提取免疫細胞進行分析，結果顯示：CD4+T細胞、CD8+T細胞在AAV注射后14天達到峰值；B細胞在注射后3天達到峰值，且兩周內保持相對穩定[4]。文章中使用的scAAV是指經過ITR改造，自互補AAV（scAAV，即雙鏈AAV）繞過了第二鏈合成的限速步驟，除了提升載體遞送效率之外，還可增加體內外轉基因表達的強度、縮短開始表達時間，以及具有更高的體內DNA穩定性和更有效的環化作用，低劑量scAAV即可實現高劑量ssAAV的表達效果，可以有效降低動物實驗的成本，尤其是以豬、猴子等大型動物為研究對象的實驗。

CD25分子是IL-2R的α鏈，也是調節性T（Treg）細胞表面特征性標記分子。為了測試AAV介導的體內轉染，在小鼠免疫細胞表面表達人受體的可行性。作者構建exo-AAV，采用三質粒系統：exo-AAV質粒、rep/cap質粒（AAV8型）和輔助質粒（pAdΔF6），exo-AAV載體通過差速離心分離，用連續2輪超離心在氯化銫密度梯度下從細胞裂解液中純化[5]。成品經過qPCR檢測滴度后，應用到動物實驗。結果顯示：在肝臟中，24.4%的CD4+T細胞，12.9%的CD8+T細胞，39.7%的B細胞表達hCD25。

在本文中，作者為了增加AAV在體內的轉染效率，構建了exo-scAAV8-CBA-hCD25-GFP的載體。不僅降低了注射AAV的劑量，而且exo-scAAV8的衣殼還可以保護工具病毒，免受宿主抗體的攻擊（體內存在scAAV8抗體的患者，可以選擇exo-AAV8）；外泌體偶聯AAV后，使工具病毒感染細胞的能力進一步提高。在抗腫瘤治療中，慢病毒憑借著容量大（能攜帶6k的目的基因），能整合到宿主染色體中，介導細胞的穩定轉導，成為體外基因治療的首選；而AAV經過科學家的改造，未來可能成為體內基因治療的首選。

結語

套用一句帶貨主播的經典語錄，把AAV基因治療的價格打下來。通過兩個方面：一是改造血清型，使AAV結合特定細胞的親和力變強；二是構建特異性啟動子，增加AAV靶向特定細胞的精準性，親和力和精準性。AAV靶向組織的親和力和精準性提高了，所需AAV的劑量自然就小了，成本就降下來了。

【參考文獻】

1. Shen DD, Pang JR, Bi YP, Zhao LF, Li YR, Zhao LJ, Gao Y, Wang B, Wang N, Wei L, Guo H, Liu HM, Zheng YC. LSD1 deletion decreases exosomal PD-L1 and restores T-cell response in gastric cancer. Mol Cancer. 2022 Mar 16;21(1):75. doi: 10.1186/s12943-022-01557-1. PMID: 35296335; PMCID: PMC8925194.

2. Huang K, Fang C, Yi K, Liu X, Qi H, Tan Y, Zhou J, Li Y, Liu M, Zhang Y, Yang J, Zhang J, Li M, Kang C. The role of PTRF/Cavin1 as a biomarker in both glioma and serum exosomes. Theranostics. 2018 Feb 7;8(6):1540-1557. doi: 10.7150/thno.22952. PMID: 29556340; PMCID: PMC5858166.

3. Yu J, Wu X, Yan J, Yu H, Xu L, Chi Z, Sheng X, Si L, Cui C, Dai J, Ma M, Xu T, Kong Y, Guo J. Anti-GD2/4-1BB chimeric antigen receptor T cell therapy for the treatment of Chinese melanoma patients. J Hematol Oncol. 2018 Jan 3;11(1):1. doi: 10.1186/s13045-017-0548-2. PMID: 29298689; PMCID: PMC5751546.

4. Breuer CB, Hanlon KS, Natasan JS, Volak A, Meliani A, Mingozzi F, Kleinstiver BP, Moon JJ, Maguire CA. In vivo engineering of lymphocytes after systemic exosome-associated AAV delivery. Sci Rep. 2020 Mar 11;10(1):4544. doi: 10.1038/s41598-020-61518-w. PMID: 32161326; PMCID: PMC7066196.

5. Meliani A, Boisgerault F, Fitzpatrick Z, Marmier S, Leborgne C, Collaud F, Simon Sola M, Charles S, Ronzitti G, Vignaud A, van Wittenberghe L, Marolleau B, Jouen F, Tan S, Boyer O, Christophe O, Brisson AR, Maguire CA, Mingozzi F. Enhanced liver gene transfer and evasion of preexisting humoral immunity with exosome-enveloped AAV vectors. Blood Adv. 2017 Oct 16;1(23):2019-2031. doi: 10.1182/bloodadvances.2017010181. PMID: 29296848; PMCID: PMC5728288.