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外泌體/鐵死亡——多熱點如何應用于腫瘤研究

吉凱基因

2021.12.08

國自然的多熱點聯(lián)合，會碰撞出什么樣的火花呢？小編今天將和大家分享近兩年國自然研究中一直持續(xù)火熱的兩大研究熱點：鐵死亡和外泌體，將以2篇文獻解析的形式了解多個研究熱點是如何配合進行機制研究的。

綜合近5年的國自然的中標基金項目金額和項目數(shù)可以看出，鐵死亡和外泌體的課題研究熱度持續(xù)上升，并且多聚焦在腫瘤、神經(jīng)、中醫(yī)藥等學科領域。

注：作圖數(shù)據(jù)來源于MedSci

為了提高科學研究的創(chuàng)新性，很多老師采取多熱點聯(lián)動的策略不失為創(chuàng)新點和小小的捷徑，為此小編和大家分享如下2篇研究，獲得一些啟迪。

研究熱點：

外泌體、鐵死亡和藥物抵抗

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研究背景

鐵死亡是依賴于細胞內(nèi)鐵的累積而引起毒性脂質(zhì)過氧化物ROS升高的非凋亡細胞死亡形式。腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)可以通過分泌包括外泌體在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)促進腫瘤進展和耐藥性。然而CAFs在調(diào)節(jié)腫瘤細胞脂質(zhì)代謝和鐵死亡中的作用仍未可知，基于此作者開始了這篇研究。

研究結(jié)論

1. 在腫瘤進展、化學治療等條件刺激下，CAFs細胞中的異質(zhì)核糖核蛋白A1（hnRNPA1）在泛素特異性蛋白酶7（USP7）作用下去掉 “死亡標簽”Ub而穩(wěn)定存在；

2. hnRNPA1與胞內(nèi)的miR-522互作，并作為 “蛋白支架”以外泌體形式被運送至旁邊的GC cells中，引起GC中miR-522的上調(diào);

3. miR-522可以和ALOX15的mRNA結(jié)合下調(diào)ALOX15蛋白（參與脂質(zhì)過氧化的調(diào)控），引起脂質(zhì)ROS的降低，最終導致鐵死亡的抑制。

圖1-1：作用機制模式圖

思路詳情

●?目的基因的篩選：蛋白組學LC-MS/MS

質(zhì)譜分析癌和癌旁中差異表達的蛋白，并篩選出與鐵死亡通路相關的差異表達變化較大的基因作為候選目的基因，并通過WB、qPCR、IHC驗證此差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與鐵死亡調(diào)控的蛋白ALOX15于癌中較癌旁低表達，且高表達ALOX15的患者其總生存期較長，從而提示ALOX15可能作為GC中一種抗癌因子。

圖1-2：差異基因篩選和驗證

●?外泌體檢測：電鏡、WB、NTA、外泌體吞噬

作者分離并鑒定了正常和癌癥病人中的血清外泌體，并發(fā)現(xiàn)miR-522在腫瘤患者的血清和腫瘤樣本中都呈高表達。且發(fā)現(xiàn)正常癌旁樣本中高豐度的細胞群NFs較腫瘤相關成纖維細胞CAFs、原代腫瘤細胞（TC cells），其分離得到的外泌體更多，且miR-522在CAFs中豐度更高。

圖1-3：外泌體抽提和鑒定

●?鐵死亡檢測：細胞死亡、線粒體膜蛋白MMP、脂質(zhì)ROS含量

胃癌細胞SGC7901和MKN45作為細胞模型，發(fā)現(xiàn)CAF外泌體可以逆轉(zhuǎn)在鐵死亡誘導劑Erastin作用下的細胞死亡和ROS累積，而CAFs外泌體中去除miR-522后，此逆轉(zhuǎn)效應消失，從而證明CAFs來源的miR-522可以通過抑制鐵死亡促進腫瘤細胞增殖，如圖1-4。

圖1-4:CAFs分泌的外泌體抑制GCs細胞的鐵死亡

從而說明CAFs通過分泌外泌體miR-522，靶向ALOX15，阻斷脂質(zhì)-ROS積累，抑制癌細胞的鐵死亡。從而揭示GC通過USP7、hnRNPA1、exo-miR-522和ALOX15信號通路獲得性耐藥的新機制。

研究熱點：

外泌體、m6A、鐵死亡、

microRNA、藥物抵抗

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研究背景

外泌體作為體內(nèi)的“小信差”可以攜帶miRNA到受體細胞影響其增殖和化學抵抗，作者希望探究外泌體來源的miRNA是否參與調(diào)控非小細胞肺癌順鉑耐藥株的敏感性。

研究結(jié)論

通過生物信息學分析和熒光素酶檢測，確認METTL3是miR-4443的直接靶基因。進一步的機制分析表明，miR-4443通過METLL3以m6A方式調(diào)控FSP1的表達。

思路詳情

●?外泌體檢測：電鏡、NTA、WB、外泌體吞噬

圖2-1：敏感和耐藥腫瘤樣本中外泌體的鑒定和吞噬

首先作者從腫瘤樣本中分離到了外泌體，并通過檢測外泌體的形態(tài) (圖2-1 A)、大?。▓D2-1 B）、分子指標（圖2-1 C左）、外泌體吞噬（圖2-1 C右）確認所抽提外泌體的質(zhì)量，并通過PKH67標記確認外泌體可以進入到順鉑敏感株（Cis-S）和耐藥株（Cis-R）中。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑敏感的腫瘤組織（Cis-S）中的miR-4443較對照組織表達低，而順鉑耐藥的腫瘤組織（Cis-R）中表達最高，大概有5倍的差異，細胞中得到相同的結(jié)論。并且發(fā)現(xiàn)，外泌體來源的miR-4443可誘導受體細胞產(chǎn)生順鉑耐藥性。

●?鐵死亡檢測：細胞活力、ROS、Fe2+、WB（FSP1，抑制鐵死亡）

圖2-2：miR-4443促進細胞鐵死亡

由以上的鐵死亡指標檢測可知miR-4443可通過誘導順鉑敏感株的鐵死亡。為更一步證實此結(jié)論，作者通過添加鐵死亡相關誘導激活劑（Erastin）、抑制劑（Fer-1）檢測順鉑刺激條件下鐵死亡的相關指標，如圖2-2：細胞中Fe2+、脂質(zhì)ROS、線體體中SOX（圖2-3 D）以及WB（FSP1），發(fā)現(xiàn)miR-4443可以上調(diào)鐵死亡抑制劑FSP1,抑制細胞鐵死亡。

圖2-3：Cisplatin誘導A549敏感株細胞的鐵死亡

那么miR-4443對于FSP1的調(diào)控是如何實現(xiàn)從而影響鐵死亡的呢？生信分析發(fā)現(xiàn)METTL3這個甲基化轉(zhuǎn)移酶是miR-4443的下游靶標，并且通過雙熒光素酶實驗證實了miR-4443可以和METTL3的3’UTR結(jié)合，從而調(diào)控METTL3的翻譯，如圖2-4。

圖2-4：雙熒光素酶實驗

生信分析后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SP1 mRNA有5個m6A sites，位置分別是2270, 2413, 4241, 4245 和16006（圖2-5 B），從而提示可能FSP1通過m6A修飾影響其蛋白的翻譯。通過檢測敏感細胞株和藥物抵抗細胞株中的總體m6A修飾后發(fā)現(xiàn)，miR-4443顯著抑制了整體m6A修飾，并且過表達miR-4443后發(fā)現(xiàn)，A549敏感株細胞中FSP1的m6A修飾顯著降低；添加miR-4443抑制劑后，A549藥物抵抗株中的FSP1的m6A修飾顯著升高（圖2-5 C）。

綜上miR-4443通過METTL3/FSP1介導的鐵死亡通路在NSCLC中的順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。

圖2-5：miR-4443參與調(diào)控FSP1的m6A修飾

關于鐵死亡研究中需要檢測哪些指標可以點此參閱

外泌體研究中需要檢測哪些指標

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