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色譜柱孔徑的選擇及其對分析結(jié)果的影響
孔徑是指填料顆粒的孔或腔的平均尺寸，常見范圍是100～300?，多孔色譜填料與目標(biāo)物的作用絕大部分（＞95%）是發(fā)生在填料顆粒的內(nèi)部，即孔內(nèi)的，所以孔徑對于色譜填料而言也是最重要的參數(shù)之一。一款填料孔徑大小和孔徑分布，在絕大多數(shù)的色譜分離純化中，起到關(guān)鍵性作用。
? 大孔徑的填料顆粒可以延長大分子溶質(zhì)在填料表面的滯留時間，達(dá)到充分分離，改善峰形，所以大孔徑填料適合分離大分子化合物或者水動力體積較大的分子。
? 較小孔徑提供較高的表面積，可用于較大的載荷量，并保留小的有機(jī)化合物，可用于小分子有機(jī)物到聚合物的分離。
選擇多大孔徑的柱子是根據(jù)分子量的大小來確定的：
樣品分子直徑小于平均孔徑才能進(jìn)入微粒內(nèi)部，通常孔徑直徑需要大于分子直徑的3倍以上才不會對分析造成影響，所選色譜柱孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍。因此理論上來講，分子量10000以下的化合物要用120?的柱子來分析，分子量大于1W小于20W的要用300?的來分析，分子量大于20W的就要用凝膠柱了。
而在實際色譜柱選擇時，則一般按照以下方式選擇：
分子量＜2000， 選擇孔徑80～180?；
分子量＞2000，選擇孔徑300?，300?全多孔色譜柱可用于分離蛋白質(zhì)和多肽。
如果分子量太大，在填料為120?孔徑的柱子上分離度會比較差。因為樣品分子在色譜柱上有較好的保留是因為可以進(jìn)入到填料的微孔里面，與鍵合在微孔表面的C18長鏈相互作用。分子量太大無法進(jìn)入填料微孔中，兩相分配少分離度就會變差，同時會影響峰形。
應(yīng)用案例
乳鐵蛋白項目
客戶使用月旭Xtimate??C4，120?色譜柱分析譜圖如下：
色譜峰分叉，分析效果不理想。
乳鐵蛋白分子量范圍是：75000-80000，故改用色譜柱Ultimate? XB-C4，300?，分析譜圖如下：
峰形良好。
結(jié)論：
色譜柱孔徑的選擇對分析結(jié)果存在一定影響，需要根據(jù)分析物的分子量大小來確定合適的孔徑，以達(dá)到最優(yōu)的分析效果。
月旭Xtimate??C4 300?色譜柱，明日火熱上線，敬請關(guān)注！
參考資料來源：儀器分析網(wǎng)
作者：況熙
排版：趙林
審核：任興發(fā)
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