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No.210｜藥典中桔梗皂苷D的分析探索：檢測器、進樣量、有機相、柱溫和色譜柱

大曹色譜
2022.4.08

大阪曹達｜三耀精細

?第210條推送 ??每周五17:00準時更新

桔梗藥材為桔?？浦参锝酃５母稍锔?。春、秋二季釆挖，洗凈，除去須根，趁鮮剝去外皮或不去外皮，具有干燥。宣肺，利咽，祛痰，排膿。用于咳嗽痰多，胸悶不暢，咽痛音啞，肺癰吐膿的功效。

2020版中國藥典一部規定以蒸發光散射檢測器（ELSD）檢測，理論塔板數按桔梗皂苷D峰計算應不低于3000。

桔梗皂苷D

選用柱流失更小的CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6mm i.d.×250mm色譜柱，使用高靈敏度氣溶膠檢測器NQAD，對對照品和供試品進行了測定。

結果如圖1所示，桔梗皂苷D對照品以10 μg/mL進樣，得到色譜峰理論塔板數為16606，不對稱因子為 0.96。供試品中桔梗皂苷D理論塔板數為21085，不對稱因子為1.02 ，與前后基質峰分離度分別為 1.52和1.89，符合藥典理論塔板數不小于3000要求。

圖1 對照品與供試品分析色譜圖

【液相條件】

色譜柱：CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6mm i.d.×250mm

流動相：水/乙腈=76/24

流? ?速：1.0 mL/min

溫? ?度：35℃

檢? ?測：NQAD，氣化溫度30℃，蒸發溫度35℃，filter 5

對照品：桔梗皂苷D，10 μg/mL（溶劑：甲醇）

供試品：按藥典要求配置

進樣量：10 μL

?討 論?

1、關于線性和定量限

藥典中以ELSD檢測器進行檢測，由于ELSD為對數相應，因此藥典在測定法中規定，分別精密吸取對照品溶液10 μL、20 μL，供試品溶液10～15 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法對數方程計算，即得。

對于NQAD檢測器來說自身為線性響應，因此我們直接以4、20、100、500 μg/mL濃度下，分別進樣10 μL，驗證線性區間和線性方程，得到線性如圖2所示。在4-500 μg/mL濃度范圍內，r=0.9998，線性良好。以S/N=10計算定量限約為3.1 μg/mL（31ng）。

圖2 對照品線性圖

2、關于進樣量

以不同進樣體積進樣時，由于溶劑效應的影響，在20 μL進樣量下色譜峰容易出現前延，導致峰面積較實際值小的問題，以該方式定量計算有可能造成較大誤差。

圖3 不同進樣量下峰型變化

3、有機相比例

有機相比例對保留時間影響較大，即使只有1%的有機相變化，保留時間差別在10min左右。因此，在不同儀器或不同人員配置時，有可能由于比例的微小誤差導致不同的實驗結果。

為了獲得桔梗皂苷D與前后基質良好分離，我們最終選擇了24%乙腈比例進行分析。

圖4 不同有機相比例對比

4、柱溫影響

柱溫越低，保留時間越長，但對分離情況影響不大。

圖5 不同柱溫比較

5、色譜柱影響

在嘗試不同類型色譜柱時，發現在氣溶膠檢測器下，使用不同C18鍵合色譜柱得到的譜圖基線有一定差別，使用柱流失更小的色譜柱（C18 MGIII）有利于得到平穩基線和更好信噪比結果。

圖6 不同色譜柱對比結果

NQAD和ELSD的靈敏度對比

ELSD（蒸發光散射檢測器）作為一種通用型檢測器被大家廣泛認可，在使用中無需待測物具有發色基團，具有對溫度變化不敏感、基線穩定等特點，但由于其靈敏度和重現性較差，在使用中也會對研究者造成困擾。

而NQAD通過放大待測物的顆粒體積得到了更高的靈敏度。下圖為不同有機相（乙腈）比例下對0.1 mg/mL三氯蔗糖進行測定時，信噪比的變化示意圖。從圖中可以看到，在0-80%的乙腈比例內，NQAD的信噪比遠大于ELSD（在60%乙腈比例時達到峰值）。實驗中80%乙腈下，NQAD的靈敏度較ELSD提高了近50倍。

參考文獻：

J.P. Hutchinson, J. Li, W. Farrell, E. Groeber, R. Szucs, G. Dicinoskia, P.R. Haddad,Comparison of the response of four aerosol detectors used with ultra highpressure liquid chromatography, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 1646–1655.

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