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天美講堂丨光學顯微鏡中的照明技術

天美公司分析儀器

2023.10.23

要? 點

1.大多數樣品均可用正置顯微鏡，但大體積樣品或成像過程中需要從上方放入的樣品需要倒置顯微鏡。

2.反射照明模式適用于不透明或較厚的樣品，而透射照明模式適用于透明或較薄的樣品。

3.明場模式最適合觀察樣品上的吸收特征，而暗場模式適合觀察樣品上的散射特征（如邊緣和缺陷）。

光學顯微鏡簡介

在本文中，我們將介紹一些最常見的光學顯微鏡術語，包括正置顯微鏡和倒置顯微鏡，反射和透射照明模式以及明場和暗場照明模式，并討論了它們在不同研究領域的適用性。

正置顯微鏡與倒置顯微鏡

選擇顯微鏡時的一個重要考慮因素是物鏡相對于樣品的位置。在正置顯微鏡中，物鏡位于樣品上方；而在倒置顯微鏡中，物鏡位于樣品下方。盡管在結構和外觀上存在差異，但它們對樣品具有相同的成像能力，可適用于不同的樣品類型。

用正置顯微鏡觀察樣品時，樣品表面朝上（朝向位于樣品臺上方的物鏡）。大多數樣品都可用正置顯微鏡成像，并可放置載玻片，孔板以及專門的溫度、壓力或電化學樣品臺。然而，有兩種情況不適合用正置顯微鏡，即當樣品太大而無法放在物鏡下面時或在成像過程中需要從上方放入樣品。這兩種情況下，都需要倒置顯微鏡。

圖1 正置和倒置顯微鏡中物鏡相對于樣品臺和樣品的方向。

在倒置顯微鏡中，樣品表面朝下（朝向位于樣品臺下方的物鏡），這表明至少樣品的這一側必須是平的。倒置顯微鏡更適合活細胞成像，其中一個例子是樣品為活細胞培養系統（其中細胞沉到培養系統的底部，并且需要從上方進入以交換液體介質）。

反射照明與透射照明

由于可以用顯微鏡觀察到從不透明半導體芯片到半透明組織培養物等一系列光學性質各異的樣品，因此大多數用戶可根據具體樣品選擇反射或透射照明模式。如圖2所示，此為正置顯微鏡兩種照明模式下的光路示意圖。除此之外，倒置顯微鏡也有這兩種照明模式。

圖2 有反射（紅色）和透射（藍色）照明模式的正置顯微鏡。

如圖2中的紅色光路所示，反射照明模式被認為是任何不透明樣品（如半導體芯片、聚合物、油漆、紙張、金屬和藥品）進行可視化的最佳模式。當使用反射照明模式觀察樣品時，光通過物鏡到達樣品表面，然后在從樣品反射后重新進入物鏡。在重新進入物鏡時，光線同時到達相機中，實現對樣品的可視化。

圖3 固定在載玻片上的脂肪肝組織切片的反射和透射照明。

當對非常薄或透明的樣品進行成像時，例如固定在載玻片上的細胞或組織培養物，透射照明是優先選擇。如圖2中的藍色光路所示，使用透射照明時，光穿過樣品并進入物鏡，從而更好地觀察透明樣品的形態。在透射模式中，由于入射光不像在反射模式中那樣通過物鏡，而是由位于物鏡相反側的聚光鏡收集來自透射的光，并將其集中到樣品上。在具有兩種照明模式的顯微鏡中，通過按下框架上的切換開關可以改變光路的方向。圖3為兩種照明模式下的樣品，其中透射照明比反射照明對比度更好。

明場照明與暗場照明

光學顯微鏡中有兩種主要的照明模式，明場和暗場。圖4所示的反射明場照明模式中，光線通過半鍍銀反射鏡反射到物鏡中心。在反射暗場照明模式中，接入擋光板，反射鏡變為全鍍銀環形反射鏡，使光束沿物鏡邊緣向下。

圖4 顯微鏡內反射明場照明模式和反射暗場照明模式的差異。

這兩種照明模式的不同之處主要在于入射光的角度。一般來說，明場為從樣品水平面45度到90度之間的銳角照射，而暗場為從0度到45度之間的斜角照射，如圖5所示。在明場模式下，銳角光如果不被吸收，則主要被反射回物鏡。這意味著吸收特征將在明亮的背景下呈現黑暗。而暗場模式中，由于傾斜入射角，光通常不被反射到物鏡中，從而導致暗背景。暗場模式用于檢測樣品中的缺陷和邊緣，缺陷和邊緣會導致斜角照射的入射光被散射到物鏡中。

圖5 ?A) 明場和暗場入射角的差異；B) 暗場缺陷散射光的檢測。

暗場需要專門的光學器件，對于反射暗場（如圖4所示），需要專門的暗場物鏡和鼻架。透射暗場也適用，需要一個暗場聚光鏡。如圖6所示，樣品為固定在載玻片上的各種硅藻組成，其中暗場照明比明場照明提供更好的對比度。從暗場照明圖像中可以看出，將光散射到物鏡中的硅藻的邊緣和精細結構與背景形成了很好的對比，并且對比度相對于明場模式有顯著改善。