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三大色譜定量方法優缺點大PK！
三大色譜定量方法優缺點大PK！
01
外標法（標準曲線法、直接比較法）
首先用欲測組分的標準樣品繪制標準工作曲線。具體作法是：用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準確量進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線，此標準工作曲線應是通過原點的直線。若標準工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統誤差。標準工作曲線的斜率即為絕對校正因子。
當欲測組分含量變化不大，并已知這一組分的大概含量時，也可以不必繪制標準工作曲線，而用單點校正法，即直接比較法定量。單點校正法實際上是利用原點作為標準工作曲線上的另一個點。因此，當方法存在系統誤差時（即標準工作曲線不通過原點），單點校正法的誤差較大。因此規定，y=ax+b， b的絕對值應不大于100%響應值是y的2%。
優點：繪制好標準工作曲線后測定工作就很簡單了，計算時可直接從標準工作曲線上讀出含量，這對大量樣品分析十分合適。特別是標準工作曲線繪制后可以使用一段時間，在此段時間內可經常用一個標準樣品對標準工作曲線進行單點校正，以確定該標準工作曲線是否還可使用。
缺點：每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應性能，柱溫度，流動相流速及組成，進樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現較大誤差。另外，標準工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標準樣品（或已知準確含量的樣品），因此對樣品前處理過程中欲測組分的變化無法進行補償。
02
內標法
選擇適宜的物質作為欲測組分的參比物，定量加到樣品中去，依據欲測組分和參比物在檢測器上的響應值（峰面積或峰高）之比和參比物加入的量進行定量分析的方法稱為內標法。
內標法的關鍵是選擇合適的內標物。內標物應是原樣品中不存在的純物質，該物質的性質應盡可能與欲測組分相近，不與被測樣品起化學反應，同時要能完全溶于被測樣品中。內標物的峰應盡可能接近欲測組分的峰，或位于幾個欲測組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊，即完全分開。
優點：進樣量的變化，色譜條件的微小變化對內標法定量結果的影響不大，特別是在樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內標物，然后再進行前處理時，可部分補償欲測組分在樣品前處理時的損失。若要獲得很高精度的結果時，可以加入數種內標物，以提高定量分析的精度。
缺點：選擇合適的內標物比較困難，內標物的稱量要準確，操作較麻煩。使用內標法定量時要測量欲測組分和內標物的兩個峰的峰面積（或峰高），根據誤差疊加原理，內標法定量的誤差中，由于峰面積測量引起的誤差是標準曲線法定量的2-2是由于進樣量的變化和色譜條件變化引起的誤差，內標法比標準曲線法要小很多，所以總的來說，內標法定量比標準曲線法定量的準確度和精密度都要好。
03
標準加入法
標準加入法實質上是一種特殊的內標法，是在選擇不到合適的內標物時，以欲測組分的純物質為內標物，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入欲測組分純物質前后欲測組分的峰面積（或峰高），從而計算欲測組分在樣品中的含量的方法。
優點：不需要另外的標準物質作內標物，只需欲測組分的純物質，進樣量不必十分準確，操作簡單。若在樣品的前處理之前就加入已知準確量的欲測組分，則可以完全補償欲測組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法。
缺點：要求加入欲測組分前后兩次色譜測定的色譜條件完全相同，以保證兩次測定時的校正因子完全相等，否則將引起分析測定的誤差。
選擇內標物有4個要求：
?1、內標物應是該試樣中不存在的純物質；
?2、它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；
?3、加入內標物的量應接近于被測組分；
?4、色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。
內標法的優點是測定的結果較為準確，由于通過測量內標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合適的內標物也有困難。
外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結果。
內標與外標都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡單而有效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。
下面用幾個例子來說明：
案例1：以前做過很多醫藥、農藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現性與穩定性非常差，結果經常受到搞合成同事的質疑。其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析，首先我們的實驗室儀器和手段是否調整到一種穩定而合理的狀態了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對于精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個方法用外標法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談論這個方法是否適用就有失偏頗了。
在做過的許多出口產品的定量分析方法當中有許多是一些醫藥公司提供的比較完善而驗證過的方法，內標與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內標外標，都是可行的，當然有一個分析成本和分析時間的問題，內標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當然要比外標要高和麻煩一些了。而有些時候，可能受你實驗室現有儀器和附屬設備的影響，達不到一定的要求，而還必須進行定量分析，有時外標的結果可能就要差一些，這時，你可能就要考慮用內標法了，可以排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內標可能就顯示出它的優勢來了。
案例2：上面已經提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，RSD都滿足1.5%的要求時，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結果小于1%，那這個方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動時，這個方法的可行性就將受到質疑，畢竟這是方法驗證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近，就要嘗試內標了，如果內標結果的RSD很好，就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大，只能用內標了，或者干脆將原方法做大的變動，再嘗試用外標法測試。
案例3：而對于微量分析，比如農藥和獸藥殘留的分析、環境分析等，根據不同的限量標準要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時可以允許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應用空間。
案例4：單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個人認為還是內標優于外標。曾經做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內標，RTX-5amine（堿改性）15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內標物）自動進樣器進6針，目的物（二氨基丙醇）與內標物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%，而只對這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結果為0.71%，通過這一實例的結果大家就會發現到底哪個方法精密度更好了，當然是內標更好了。當然這個化合物的檢測方法最后根據上面的驗證數據用內標和外標定量都是可以的，實驗室可以自由選擇。但內標與外標精密度結果的差異是顯然存在的事實。
