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反相液相色譜方法開發的AQbD工作流程
該文章是Pfizer分析科學家發表的一篇關于AQbD理念在HPLC方法開發中的應用文章。文章結合Inlyta(阿昔替尼)有關物質方法開發過程，詳細闡明了AQbD在方法開發的全過程中的應用。對于分析科學家而言，可以對AQbD理念的理解帶來一定的啟發。感興趣的讀者可以閱讀原文，以下是對原文大部分內容的翻譯。
01引言
如ICHQ8、Q9和Q11所述，質量源于設計(QbD)在藥物原料藥和制劑工藝的開發和制造中得到很好的確立。從高層次來看，QbD的目標是保證工藝過程能夠始終如一地提供預期性能的優質產品。在工藝開發過程中獲得的知識有助于證明設計空間和（過程）控制的建立是合理的。而可操作空間內（監管批準的）的任何設定點都將產生可接受的產品，并且工藝條件在可操作空間內的更改是（監管）可接受的。
這些相同的原則和概念已應用于方法的開發，并被稱為分析QbD(AQbD)。類似于工藝QbD，AQbD的目標是設計一種質量可靠的分析方法，始終如一地提供預期性能。而在方法開發、優化和驗證過程中獲得的知識有助于建立方法可操作設計區域(MODR)，從而獲得方法的耐用性空間。
合適的（針對其預期目的）分析方法提供關鍵數據，以支持對藥物材料（例如原料藥、中間體、原料、輔料）的理解和控制。對于原料藥，雜質和含量數據對于工藝的開發、優化和后續控制至關重要。對于制劑，含量和雜質方法可以幫助理解工藝過程、劑型均勻性以及與賦形劑之間的相互影響。這些方法的結果經常用于了解進行加速降解研究（有目的的降解和加速穩定性評估程序）和正式穩定性研究的原料藥和制劑的降解機制。這些方法用于確保原料藥和制劑在放行和整個保質期內的質量，是確定儲存條件和有效期的基礎。分析方法是提供及時、高質量數據的工具，這些數據通常包含在監管文件中。因此，藥物分析化學家必須確保所開發的分析方法適合其預期目的，并在整個方法生命周期內持續提供適當的數據。
然而分析方法開發沒有固定模式，從使用“最喜歡的”色譜柱、固定相或供應商到使用軟件輔助進行系統的方法篩選或介于兩者之間的方式均可。沒有“正確的”方法;然而，更系統的方法開發工作流程將比不太系統的方法更快地更好地了解方法的分離空間和穩健性。整個方法開發過程證明該方法適合其預期目的，通過方法驗證并保證后續使用。符合其預期目的是一個關鍵概念，整個方法開發過程均圍繞這一目的進行，必須充分了解方法需求（例如目的、特異性、靈敏度、準確度和精密度）。
在AQbD框架中開發的分析方法通過一系列步驟進行（圖1）。第一步是明確分析目標概況(ATP)，從而確定方法要求和性能標準。根據方法的需要，選擇一種分析技術，使方法能夠滿足預期的目標。根據獲得的特定項目方法開發知識和經驗，執行風險評估(RA)及識別需要進行實驗設計(DOE)評估的風險因素。DOE 將產生MODR和控制策略（方法參數設置點和明確操作空間）。MODR內的一個點將被指定為該方法的正常操作條件(NOC)，并且NOC條件將被驗證。最后部分涉及知識管理（從方法開發、優化、驗證和使用中獲得的知識），應在方法的整個生命周期中保留和轉移。
遵循AQbD流程開發分析方法有很多好處。首先且最重要的是，方法將建立在對分析要求和性能的理解基礎上。由此產生的方法開發知識、方法穩健性和可轉移性將使得方法更穩健，減少方法失敗和轉移問題。AQbD的另一個潛在好處包括增加監管靈活性。這根據該方法的歸檔策略和監管接受程度來實現。
AQbD 概念在最近批準的藥物阿昔替尼(Inlyta)的穩定性指示方法的開發中得到了證明。該方法開發過程充分利用了樣品的結構知識和基于軟件的決策支持。AQbD工作流程從了解方法需求(ATP)開始，然后是選擇分析技術、制定篩選策略（Wave 1）和初步條件的優化（Wave 2 和Wave 3）、根據篩選階段獲得的知識進行風險評估，最后通過DoE實驗構建設計空間并明確可操作空間。最終獲得一種穩健的色譜方法，具有易于理解的MODR和該方法的中心點。與傳統方法相比，AQbD工作流程的使用簡化了方法開發所需的時間和資源。從接收關鍵預測樣本集(KPSS)到確認中心點的整個AQbD過程大概需要兩周，大約一半的時間分配給信息學方面。但是，并非所有方法都會在此時間范圍內完成。
02
項目背景介紹
表1顯示了本研究中每個目標化合物的結構。這些樣本構成了該方法的關鍵預測樣本集 (KPSS)。
表1. 目標研究對象
03
分析目標概況(ATP)分析
ATP是對測量系統要求的前瞻性總結，如果達到該要求，將確保在該產品的整個生命周期內對特定產品質量屬性進行準確評估。ATP并不限定于特定的方法或技術，因為如果任何分析技術符合ATP標準，則可以對其進行評估。下面提供了一個 ATP分析示例，用于分析阿昔替尼薄膜包衣片的含量和純度。
含量：該方法必須能夠在主濃度70-130%范圍內準確定量薄膜包膜片中活性藥物成分(API)，并具有專屬性、線性、準確性和精密度，使測量值在真實值的正負3.0%之內，且有95%的準確率。
純度：在原料藥、輔料和雜質存在的情況下，該方法必須能夠在報告和標準要求范圍內準確定量與API相關的已知和未知雜質。方法的專屬性、線性、準確度和精密度需要滿足對于<0.15%水平的雜質其測量值在真實值的正負20%之內，準確率為80%；對于>0.15%水平的雜質其測量值在真實值的正負15%之內，準確率為90%。
04
反相色譜方法開發
許多因素都會影響色譜專屬性。通常探索的因素包括色譜柱種類、水相（pH值和緩沖液類型）、有機溶劑類型、溫度、梯度斜率等。為了獲得有效的方法開發工作流程，我們制定了一個四步策略（圖2）在進行DoE實驗以獲得MODR之前，廣泛探索KPSS的分離空間。在此AQbD工作流程中，起點是獲得Log D圖（如果KPSS中化合物的結構已知）。實驗步驟包括評估：(1)流動相pH、強洗脫劑和色譜柱種類；(2) 小范圍pH 值篩選；(3)溫度梯度優化。
Wave0 方法開發前的知識準備
預測已知結構的目標物的Log D值。就反相LC研究而言，Log D的大小和物質保留密切相關。所有目標分析物的pH VS Log D的疊加圖可用于直觀地了解到所有目標分析物在pH1-14范圍內log D值隨pH變化的情況。圖3是本研究中使用的化合物（列于表1）的pH vs log D 疊加圖。從該圖中可以看出，在pH6-11范圍內，目標分析物的log D值基本保持一致，說明在該pH范圍內物質的保留不受pH的調動。在pH1-6和pH>12范圍，屬于log D的變動區，流動相pH的稍微變動會導致物質保留時間較大的改變，并且化合物6在低pH條件下可能無法保留。分析KPSS的pH vs Log D疊加圖，可以在篩選策略制定之前分析要篩選的pH條件。如果流動相pH值選在log D變動區（流動相pH接近化合物的pKa）,在進行色譜峰識別時需要格外注意。
Wave1 方法篩選策略的制定
在制定方法策略時，首先對分離影響最大的色譜參數，如色譜柱種類，流動相pH和強洗脫種類進行了廣泛的研究，獲取對分離影響最大的關鍵因素信息，以便在方法優化階段進行DoE設計時參數的選擇。最終的制定的篩選策略如下表。
查看所有實驗數據后，最后選擇ACQUITY UPLC BEH C18 柱、10mM 醋酸銨緩沖液(Ph=6.65)和乙腈溶劑作為方法優化的起點。該方法對應的色譜圖如圖4所示，大約8分鐘內實現了11個組分的基線分離。其中選定的pH條件屬于所有目標物的logD穩定區。
Wave2 方法pH建模
盡管在wave1中獲得了對所選條件獲得了一些基本了解，但仍需要進行額外的實驗，以進一步改進方法并了解其可操作范圍。在進行pH優化時色譜柱種類的有機相種類保持一致。由于流動相pH值的微小變化，對分離的穩定性仍然不確定。如果樣品組中的分子在所選pH值附近具有pKa，則流動相pH值或離子強度的輕微變化可能會顯著改變選擇性。需要在較窄的 pH范圍內進行實驗，以明確方法的pH耐用性范圍。Wave2實驗旨在了解pH值對分離的影響，最終目標是將最終方法設置在pH耐用性范圍的中心處。
最終pH模型如下圖所示。從圖中可以看出，pH在5.8-7.0的范圍內均能滿足最小分離度大于1.5的要求，且當pH為6.5時分離度最大。通過pH模型不僅知道了最好pH條件為6.5，而且還知道當選定流動相pH為6.5時，方法流動相的pH值有±0.5的耐用性空間。
Wave3 梯度&溫度2D模型
該步驟的主要目標是優化梯度和溫度，以便進一步明確關鍵色譜峰對的分離度、運行時間和方法穩健性。通過溫度和梯度兩因素的DoE實驗，構建出如下圖所示的分離度圖。圖中橙色代表分離度好的區域，藍色代表分離度差的區域。通過2D模型，可以同時研究溫度和梯度兩因素相互作用對關鍵色譜峰對的分離度影響。最后，綜合考慮運行時間和分離度，選擇圖中紅色點對應的溫度和梯度條件作為最終的方法參數。
最后的方法參數如下表所示。
一旦確定了色譜參數的耐用性區域，將會進行風險評估（用于識別和確定風險區域的優先級）和DoEs（確定方法條件的多元穩健性區域和潛在的失敗邊緣）的附加步驟。根據DoEs評估預測替代實驗條件，并通過實驗確認最終方法中心點條件。最終MODR的確定是基于從DoEs建立的耐用性范圍設置的。
05
風險評估(Risk Assessments, RA)
RA是AQbD方法開發過程中的關鍵步驟。如ICH Q9所述：“風險評估包括危害的識別以及與暴露于這些危害相關的風險的分析和評估。”LC方法風險評估的目的是建立高可信度的分析方法，使其在整個生命周期中將滿足所有使用條件下的所有性能標準。采用系統方法識別可能需要控制以確保方法性能的所有潛在方法因素。風險評估工具和DOEs用于了解和管理風險領域。為了在不同的開發階段有效地評估和降低方法風險，使用了基于分層的方法。基于Excel問卷的風險評估用于尚未達到ICH階段的產品。問卷式RA方式以科學知識、RPLC方法中常見問題為基礎，側重于“典型”方法問題評估。評估內容包括分析物物理化學特性、流動相、儀器、色譜柱和檢測部分。表4顯示了對最終Wave3方法執行的基于Excel的RA的分析。
表4中各單詞簡稱說明。(C)Control：方法中固定的實驗因素；(X)Experimental：為實驗研究選擇的參數，以了解潛在的風險和控制水平；(N)Noise：無法控制的誤差來源（例如操作員、環境因素）。
風險評分關鍵：（L）低風險：這個因素成為問題的可能性非常低。風險很容易降低；(M)中等風險：可能會影響方法屬性，可以使用標準方法（例如條件、儀器、方法中指定的參數）管理風險；(H) 高風險：風險因素可能會影響方法，并且需要通過實驗研究來了解潛在的風險和控制水平。同時為(X)和(H)的風險因素被視為關鍵參數，應通過實驗 (DOE)降低風險。
06
DOEs設計
從表4中可以看出，需要進行DoEs研究的實驗參數有流動相pH,柱溫和梯度參數。在進行具體實驗設計時，采用選中中心點后，進行高低兩水平部分因子實驗設計來確定方法穩健性并建立初始MODR。該策略采用以下工作流程：
中心點選取：根據wave3中確定的條件（表 3）建立初始中心點條件。
因子和響應選擇：選擇從RA確定的過程參數（因子）和屬性（響應），根據屬性的可接受限度設置試驗的低和高兩因子水平。Table 6中列出了 參數（因素）和屬性（響應）以及所研究的實驗范圍。 緩沖液濃度和流速設置為固定值，因此未在設計中進行實驗評估。
DoE設計選擇和設計布局：這部分工作可以借助專業的統計軟件完成，如Design-Expert,JMP和MiniTab等純統計學軟件。Resolution VI設計是允許確定重要主效應和雙因素交互作用的統計設計。Table 7中是采用Resolution VI設計實驗運行序列，其中實驗運行的隨機化通過按溫度水平對運行進行分組來限制，以便更輕松地執行實驗。因此，中心運行在整個實驗運行序列中均勻分布，以提供一種方法來測試可能在實驗期間發生的系統時間效應。這種設計能夠確定所有主效應和兩個因素的交互作用。該設計總共包含 36 針實驗，其中包括4個中心點，用于分析漂移、曲率和純誤差。
DOE HPLC分析：將DOE設計點轉換為用于HPLC分析的樣本集。 Empower中生成了儀器方法，以支持每個設計點的因子變化。在每個設計點下評估樣品，收集響應結果（例如化合物保留時間、分離度、拖尾）并匯總以進行統計分析。
DOE統計響應分析：使用統計分析軟件來評估來自DOE的數據。檢查所有回歸模型是否存在高度共線性，定義為具有方差膨脹因子 (VIF)≥10 的參數并確保其滿足正態分布。保留時間響應的每個回歸模型的調整r2平≥0.999，關鍵分離度和拖尾響應值大于 0.99。所有響應模型p值 (Prob > F)均<0.0001，表明模型一致性極佳，并且該模型在設計空間提供的指導有效的。
DOE優化：統計分析軟件用于通過使用數字和圖形優化工具通過設置響應接受極限目標交來評估多響應分析。(注釋：具體的統計模型分析過程就不在此詳述，如讀者對此感興趣可以查看原文)。最后通過對響應曲面的分心表明，方法的中心點需要進行調整以達到最佳分離度。調整后的方法見Table 8。
MODR確定：最終的MODR由臨界響應的實際線性方程定義，該方程設置為其各自的接受極限，對應于方法因子輸入值。因此，并非所有由表8中給出的可操作范圍設置的因子值組合都可能產生有效的解決方案。如表9所示，響應模型預測與針對最終方法條件獲得的實際結果非常一致，表明該模型確定的MODR具有指導意義。
07結論
本文基于QbD原理的詳細闡述了反相LC方法開發工作流程。工作流程從了解方法需求(ATP)開始，然后是技術選擇、初始色譜參數的選擇（wave1）和這些條件的優化（wave2和wave3）、風險評估及識別和DOE實驗風險評估。該方法利用樣品的結構知識、MS峰跟蹤、自動化和基于軟件的決策支持。這是一種快速有效的方法，可以最大限度地減少分析科學家花費在方法開發和數據分析上的時間，同時廣泛研究實驗變量。最終可生成一種穩健的色譜方法，具有易于理解的MODR。與傳統方法相比，尤其是在將方法轉移相關問題考慮在內時，通過AQbD原理開發方法所花費的資源在方法的整個生命周期中顯著減少。
Comments by 閻作偉:
預計ICHQ14 Guideline即將于2022年上半年發布。Q14要求分析方法開發過程具有更好的科學性和系統性，確保分析方法具有很好的耐用性和可轉移性。因此我們翻譯了2013年Pfizer的科學家的這篇文章作為AQbD流程的介紹。在國內，能做到完整AQbD流程的單位還是少數。ACD/AutoChrom其設計原理與Pfizer科學家提出的流程一致。期望在不久的將來，我們能夠達到國際一流的水平。
