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氯化石蠟的分析方法和定量流程
背景介紹
氯化石蠟是一類正構烷烴氯化產生的工業混合產品，具有低揮發性，阻燃，電絕緣，價格低廉等優點，廣泛用于增塑劑，橡膠和紡織品阻燃劑，金屬加工液等，自從20世紀30年代以來產量一直持續增加，到2016年全球產量已超過100萬噸，其中我國是產量最大的國家 [1]。氯化石蠟根據碳鏈長度可分為短鏈（C10-C13），中鏈（C14-C17），和長鏈（C18-C30），其物理化學性質和環境毒性與碳鏈長度密切相關。目前短鏈氯化石蠟（SCCPs）由于其更強的環境穩定性和生物毒性，可在環境中長期遷移并在生物體內富集引發多種環境危害，中鏈氯化石蠟（MCCPs）次之。為了對這種新型污染物進行更嚴格的監管，2017年5月，短鏈氯化石蠟（SCCPs）被列為斯德哥爾摩受控POPs名單。
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21世紀初我國開始系統性監測環境和食品中短鏈及中鏈氯化石蠟的濃度，包括水生生物，極地高原大氣，室內空氣，飲用水，肉類，母乳等。均發現氯化石蠟，而且其典型濃度比國外同等環境中測得的氯化石蠟高接近一個數量級 [2]，這應該引起我們足夠的重視。
對氯化石蠟的檢測面臨諸多技術挑戰，主要由于以下原因。
化合物數量繁多（氯化石蠟同族物及同分異構體超過1萬種）
性質相似難分離，質譜碎片也非常相近——最好用能保留足夠分子離子峰進行區分（NCI源）
檢測響應差異較大——NCI源差異特別大
容易受其他環境污染物干擾
缺乏單體標樣，且工業混標具體構成不明
經過二十多年的技術發展，環境學界陸續建立了氯化石蠟的檢測方法，特別是針對不同化學式的同族化合物（congener, 單體）的組分定量取得了一定的進展，因為不同分子式的氯化石蠟性質和毒性相差較大，其在環境中的行為和影響也各不相同，這種對不同分子式單體的組分進行定量的方式更有利于精確控制和管理這種污染物。但相比有機氯農藥，多氯聯苯等經典POPs，氯化石蠟檢測定量的準確性和可靠性都還有很大差距，這也是氯化石蠟研究和管理的主要技術瓶頸。
氯化石蠟的分析方法
對于氯化石蠟的分析手段，主要使用氣相色譜進行分離，少量研究也用液相色譜或質譜直接進樣。檢測器方面，對含氯化合物有特征響應的ECD檢測器是比較常見的選擇，也有將氯化石蠟加氫催化返回正構烷烴后進行FID檢測（碳骨架分析法），當然應用最多的還是質譜檢測器。
從電離方式來說，GC-MS常用的EI電離使用較少，主要因為氯化石蠟在經過70eV電子轟擊后，分子離子峰幾乎消失不見，而不同的氯化石蠟單體最終的離子碎片高度相似，沒有特征性。而使用甲烷做反應氣的化學電離源（負離子模式，NCI）則能保持氯化石蠟分子特征，產生碎片較少，主要保留體現分子信息的分子離子碎片 ([M-Cl]-, [M-HCl]-, [M+Cl]-)，具有高選擇性。但NCI源對不同氯含量的單體的響應差異很大，且對氯取代數少于5的氯化石蠟單體無響應；有學者在甲烷中加入少了二氯甲烷[3]，主要離子峰減少為一個（[M+Cl]-），進一步提高選擇性，減少干擾，另外對不同氯含量的單體響應差異顯著減少，同時對氯取代數少于5的單體也有響應。但由于離子源在分析后容易積碳（來源于二氯甲烷），需要經常清洗離子源，影響檢測效率和通量。另外，也有部分研究使用最新的APCI源，發現其響應因子對氯化石蠟分子中的氯取代數依賴較小，但對碳取代數依賴較大。由于氯化石蠟不同單體間，或者氯化石蠟和其他含氯化合物之間會出現質量數非常接近的特征離子碎片，使用高分辨率質譜顯然會降低干擾，提高準確性。但由于高分辨質譜昂貴的價格和復雜的維護要求，主要使用場景集中在高端科研實驗室。
氯化石蠟的定量方法
對于氯化石蠟的定量方法，可以分為總量定量和組分定量。
總量定量方法
氯化石蠟的GC譜圖（以ECD為例）由多個寬峰組成 [4]，也被形象地稱為“駝峰”或“五指峰”。每個寬峰內部包含了幾百上千個化合物，不同單體不同結構的氯化石蠟相互重疊交錯排列在幾個寬峰內，無法區分。
但因為不同氯化石蠟在ECD上的響應比較一致，所以可以將基線以上部分進行積分加和，得到氯化石蠟的總含量。缺點是無法區分不同種類的氯化石蠟（也無法區分短鏈和中鏈氯化石蠟），另外，容易受到到其他含氯化合物的干擾，影響最終檢測結果。
為了提高準確性，減少干擾，Zencak等使用EI源的串接質譜分析氯化石蠟[5]，監測三個特征MRM通道完成定量。由于該方法的質譜響應跟含氯量影響不大，可以使用一種標樣進行定量，而且干擾較少，分析速度快。不過和GC-ECD方法一樣，GC-MSMS方法還是無法區分不同分子式的氯化石蠟。
組分定量方法
單標定量法
最先提出組分定量的是Tomy團隊[6]，他們使用NCI源高分辨質譜，首先系統研究了所有24種短鏈氯化石蠟單體在NCI源質譜上的特征離子和不同離子的豐度關系，在對已知濃度標樣和樣品進行檢測后，得到不同單體氯化石蠟在標樣和樣品中的信號比例（以定量離子計算），然后根據以下公式，將實際樣品（a）和標樣（s）進行比較后，得到最終樣品中氯化石蠟的濃度。
該方法優點在于只需要一個標樣即可完成樣品檢測，但后續研究人員發現，選擇不同的標樣，最終得到的結果相差很大，原因在于NCI源對不同氯含量的氯化石蠟的響應因子有很大的差別。這樣就需要分析人員選擇和樣品中氯含量近似的標樣進行分析，而這在實際情況中幾乎很難實現。
分組定量法
如果使用的是低分辨質譜，不同氯化石蠟單體間會產生干擾，比如多5個碳原子同時少2個氯原子的單體具有相同的名義質量（比如C10H15Cl7 和 C15H27Cl5），在低分辨質譜上無法區分。為了解決這個問題，實現短鏈和中鏈氯化石蠟同時分析，Zeng 等采用了分組定量法[7]，將短鏈和中鏈氯化石蠟的定量離子分成4組，形成4種不同方法分別進樣，每組內包含了容易產生干擾的單體對（一般一個是短鏈，一個是中鏈），然后通過保留時間窗口，同位素比例，峰型等特征區分每組內容易干擾的SCCPs 和 MCCPs，利用這些干擾單體的定量離子在豐度上的差異（比較細微），建立二元一次方程組，求解得到相應單體的定量離子實際信號。這種方法提高了低分辨質譜的準確性，但每個樣品需要進四次，工作量和計算量大大增加。另外，對不同單體在質譜上形成的離子碎片相對豐度的一致性提出較高要求。
響應因子校正法
目前使用較為廣泛的組分定量方法由Reth等在2005年提出[8]。既然NCI源中氯化石蠟的響應和含氯量相關，那首先分析一系列不同氯含量的標樣，然后建立其響應因子和氯含量的（線性）關系，再通過樣品中不同單體的相對信號（峰面積）計算其氯含量（按色譜計算），然后代入之前的線性關系求得響應因子，進而得到氯化石蠟的濃度和各單體的含量。
計算步驟和公式如下：
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該方法需要事先分析多種不同氯含量的標樣，但目前工業混標基本涵蓋了環境中氯化石蠟的氯含量范圍，最終結果也證明了該方法可以顯著改進定量誤差。
解卷積法
Bogdal等提出的解卷積法假定樣品中氯化石蠟的單體組成是不同標樣的線性組合[9]，利用最小二乘求解不同標樣的貢獻因子，最終得到樣品中不同單體組分的含量。
該方法的數學意義非常清晰，但實際應用中需要測定盡可能多的標樣以提高準確性，工作量比較大，另外這也需要專業的數學工具（如MatLab）完成計算。
全二維氣相色譜氯化石蠟分析
最近十年來，全二維氣相色譜由于其峰容量大，分離效果好的優點，在氯化石蠟分析中得到了廣泛應用。不同于一維GC譜圖上的寬駝峰，在全二維譜圖中，氯化石蠟呈現出非常有規律的瓦片狀排列方式，而每一片“瓦片”上的單體則具有同樣的規律（其碳取代數和氯取代數之和相等，比如C10H15Cl7、C11H18Cl6和C12H21Cl5在同一“瓦片”上，碳取代數和氯取代數之和為17），極大提高了分離效率。而且這些在”瓦片“上重疊單體沒有重合干擾的特征離子，可以通過選擇離子輕松區分。全二維氣相色譜搭配不同檢測器，比如ECD[4]，低分辨四極桿質譜[10]，高分辨飛行時間質譜[11]，甚至靜電軌道阱質譜（食品和環境中短鏈氯化石蠟的分析）的應用都有報道。
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雪景氯化石蠟全二維分析方案
為了方便用戶使用全二維氣相色譜質譜聯用對短鏈氯化石蠟進行分析，雪景科技提供了全二維氯化石蠟分析專用方案，支持在現有GC-MS上升級成全二維系統，包括單四極桿質譜，三重四極桿質譜（GC-MS/MS），飛行時間質譜（TOFMS/Q-TOFMS）和靜電軌道阱質譜（QE），并包含優化方法包和技術支持。最后，為了簡化氯化石蠟分析流程，我們推出了短鏈氯化石蠟專用分析軟件——Paraffin Master
?這款軟件完全針對氯化石蠟分析設計，將分析流程和功能進行整合集成，包含了內置的SCCPs單體特征離子庫（24種SCCPs單體的低分辨和高分質譜定量和定性離子），也支持用戶編輯離子并保存使用。在定量方法上采用了業內最流行的響應因子校正法（Reth et al. [8]），完成氯含量計算和響應因子標準曲線繪制，并實現多樣品的定量分析和查看。所有步驟均在同一個軟件內完成，可根據特征離子自動識別氯化石蠟的單體族類范圍（支持手動調整），用不同顏色顯示不同單體族類并實時更新響應因子曲線。完全省去了用戶需要使用excel等表格工具進行公式編寫和計算的流程，將全二維譜圖分析和數值計算過程統一在一個界面上進行操作，減小錯誤率，提高檢測效率。
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這款氯化石蠟專用軟件的設計和開發得到了包括上海疾控中心，廣州地化所，浙江樹人大學，浙江大學等很多研究單位老師和同學的支持和反饋，在此對他們表示由衷感謝。另外也希望更多的同行給我們提出寶貴的建議和意見。在此我們特別推出90天免費試用的優惠活動，通過在本文下進行留言評論提出申請，或者直接聯系雪景科技，可以免費試用90天Paraffin Master，在免費試用期間，我們提供必要的培訓和技術咨詢。
注：1. Paraffin Master使用中無需安裝其他全二維色譜數據處理軟件（如Canvas等）
? ? ? ?2. Paraffin Master軟件可以讀取包括cdf格式（AIA）在內的的通用質譜數據文件，另外，某些廠家的質譜數據也可以直接讀取（請咨詢雪景工程師）
參考文獻
[1] 吳楊，基于超高效液相 -高分辨 軌道 阱質譜分析環境樣品中的短鏈和中鏈氯化石蠟，博士學位論文，中國科學院廣州地球化學研究所，2019年
[2] 吳靜，于海斌等，短鏈氯化石蠟分析方法、環境行為與健康效應的研究進展, 環境科學研究, 2022年第2期, 462-469
[3] Zencak Z, Reth M, Oehme M. Dichloromethane-enhanced negative ion chemical ionization for the determination of polychlorinated n-alkanes. Analytical Chemistry (2003) 75: 2487-2492.
[4] Xia D, Gao L, Zhu S, et al. Separation and screening of short-chain chlorinated paraffins in environmental samples using comprehensive two-dimensional gas chromatography with micro electron capture detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry (2014) 406: 7561-7570.
[5] Zencak Z, Reth M, Oehme M. Determination of Total Polychlorinated n-Alkane Concentration in Biota by Electron Ionization-MS/MS. Analytical Chemistry (2004) 76: 1957-1962.
[6] Tomy GT., Muir DCG., Fisk AT., et al., Quantifying C10-C13 polychloroalkanes in environmental samples by high-resolution gas chromatography/electron capture negative ion high-resolution mass spectrometry, Analytical Chemistry (1997) 69: 2762-2771.
[7] Zeng L, Wang T, Han W, et al. Spatial and vertical distribution of short chain chlorinated paraffins in soils from wastewater irrigated farmlands. Environmental Science & Technology (2011) 45: 2100-2106
[8] Reth, M, Zencak Z, Oehme M. New quantification procedure for the analysis of chlorinated paraffins using electron capture negative ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A (2005) 1081: 225-231.
[9] Bogdal C, Alsberg T, Diefenbacher PS, et al. Fast Quantification of Chlorinated Paraffins in Environmental Samples by Direct Injection High-Resolution Mass Spectrometry with Pattern Deconvolution. Analytical Chemistry (2015) 87: 2852-2860
[10] Zou Y., Niu S., Dong L., et al., Determination of short-chain chlorinated paraffins using comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with low resolution mass spectrometry, Journal of Chromatography A (2018) 1581–1582: 135-143.
[11] Xia D., Gao L., Zheng M., et al., A novel method for profiling and quantifying short- and medium-chain chlorinated paraffins in environmental samples using comprehensive two-dimensional gas chromatography-electron capture negative ionization high-resolution time-of-flight mass spectrometry, Environmental Science & Technology (2016) 50: 7601–7609.
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