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臨床專欄丨液質聯用技術用于血漿中曲妥珠單抗的定量分析
背景
曲妥珠單抗（Trastuzumab）是一種重組人源化單克隆抗體，可抑制HER2過度表達的腫瘤細胞的增殖，臨床上可用于HER2過度表達的轉移性乳腺癌、轉移性胃癌患者。赫賽汀（Herceptin）是羅氏原研生物制劑——注射用曲妥珠單抗，最早于1998年9月25日獲得美國FDA批準上市，之后相繼在歐洲、日本上市，2002年9月在我國上市。
血漿藥物的定量分析是任何藥代動力學臨床前和臨床研究的必要前提。在臨床用藥中，由于單抗藥物ADME個體差異大，血藥濃度的準確測定不僅為患者提供有效和安全的精準用藥指導，提高藥物療效，并且有助于深入研究藥代動力學參數和生物標志物[1,2]。經過十幾年的發展，基于液質聯用（LC-MS/MS）的蛋白定量技術正步入一個新的階段，該方法越來越多被視為抗體藥物生物分析的一個成熟平臺，常被用于臨床前研究、開發和臨床試驗。經典液質蛋白定量方法開發工作流程一般首先從樣品中提取感興趣的蛋白，經酶解成一系列多肽，并通過LC-MS/MS定量其中一個或多個特征多肽（signature peptide，SP），通過選擇合適SP和標準物質，液質方法能夠在靈敏度、選擇性、精密度和準確性方面達到或超過傳統的配體結合測定法（LBA）?[3,4]。?
本應用首先將血漿曲妥珠單抗樣本酶解，后采用96孔板固相萃取法凈化酶解后的肽段混合物，使用液質聯用MRM模式定量分析特征肽段，操作簡便，靈敏度高，方法精密度、加標回收率良好。
實驗樣品
基質：大牛血漿
表1.?化合物信息
中文名稱
英文名稱
CAS號
分子式
分子量
赫賽汀
Herceptin
180288
-69-1
C6470H10012
N1726O2013S42
145531.50
樣品前處理方法：
采用艾杰爾96孔固相萃取板Cleanert?Peptide專用板1凈化酶解后的血漿樣本，具體步驟如下：
酶解
活化，上樣
淋洗洗脫
氮干復溶
儀器分析條件?
色譜柱：?Luna Omega Polar C18，
1.6μm，2.1×50mm
流動相A相：0.1%甲酸水溶液；?
流動相B相：0.1%甲酸乙腈溶液；?
流?速：0.3mL/min；?
柱?溫：40℃；?
進樣量：10μL；
質譜儀：SCIEX Triple Quad?5500
掃描方式：多反應監測正負離子模式（MRM）
離子源類型：電噴霧離子源（ESI+）
噴霧針電壓：5500V
離子源溫度：500℃
加熱器（GS1）：60psi
輔助加熱氣（GS2）：60psi
氣簾氣（CUR）：40psi
碰撞氣（CAD）：9psi
表2.?化合物定性、定量離子和質譜分析參數
特征肽段
Q1Q3
FTISADTSK?
485.2
721.4
結果與討論
線性范圍：
配制濃度范圍20-1600ng/mL赫賽汀大牛血漿溶液作為樣品進行檢測并以外標法繪制標準曲線。得到線性相關系數r=0.9990，線性良好。
圖1. 大牛血漿基質20-1600ng/mL線性
方法精密度與準確度：
本實驗選擇400ng/mL加標平行測定3次，以外標法計算回收率與精密度結果，由表3可知回收率為103%~110%，相對標準偏差RSD小于5%；
表3. 加標回收實驗結果
特征肽段
（SP）
理論加標
濃度（ng/mL）
檢測結果
（ng/mL）
回收率%
RSD%
FTISADTSK
400
410
103
3.8
400
413
103
400
439
110
參考靈敏度：
本實驗對加入赫賽汀濃度為20ng/mL的血漿樣本進行分析，其特征肽段信噪比為32，滿足臨床TDM定量要求。
圖2. S/N為32.4的20ng/mL加標色譜圖
結論
本文建立了赫賽汀單抗血漿基質的SPE前處理方法，其20ng/mL信噪比為32，能夠滿足檢測需求，400ng/mL外標法添加回收率在103%~110%之間，RSD值均小于5%，能夠滿足標準檢測方法要求。本實驗避免了超濾管的使用，從而極大降低了樣本的檢測成本。
相關耗材產品：
產品名稱
規格描述
包裝數量
訂貨號
色譜柱
Luna?Omega?Polar?
C18, 1.6μm?
2.1×50mm
1/PK
00B-4748-AN
SPE板
Cleanert?Peptide
專用板1, 5mg
2/PK
Peptide-1-MW
保護柱卡套
Security Guard Kit
1/PK
KJ0-4282
保護柱柱芯
4×3.0mm
10/PK
AJ0-4287
飛諾美抗體藥物關鍵質量屬性解決方案
——Biozen系列
應用
色譜柱
聚集體分析
mAb片段，
較小的生物類似藥
1.8μm SEC-2
mAb聚集體
1.8μm SEC-3
完整質量數
完整質量數
3.6μm Intact C4
DAR, Middle-Down
3.6μm Intact XB-C8
肽譜
序列變異分析、
序列確認，
“符合標準”QC測試
1.7,?
2.6μm Peptide XB-C18
1.6,?
3μm Peptide PS-C18
N-連接糖譜
通過N-連接糖基釋放
和標記進行糖鏈異
質體相對豐度的分析
2.6μm Glycan
電荷異構體
分析mAb和重組蛋白的
酸性堿性電荷異構體
6um WCX
完整質量數
完整質量不僅可以指示糖型的相對豐度，還能表明穩定性，這是因為降解的mAb不會在ESI-MS下形成良好的電荷包膜。高分辨率MS所能提供的完整質量可確定翻譯后修飾，尤其是糖型的相對豐度，這將與Biozen Intact XB-C8和Biozen WidePore C4提供的快速運行時間和緊密峰形的優點完美結合在一起。
使用Biozen Intact XB-C8和SCIEX X500B表征曲妥珠單抗生物仿制藥的完整質量數
色譜柱：Biozen 3.6μm Intact XB-C8
色譜柱：150x2.1mm
貨號：00F-4766-AN
流動相：A:0.1%甲酸的水溶液
B:0.1%甲酸的乙腈／異丙醇（50:50)溶液
梯度：
時間(min)
%B
2.5
201065
10.1
95
流速：0.3mL/min
溫度：90℃
檢測：QTOF (SCIEX X500B)
樣品：曲妥珠單抗
藥物抗體比（DAR)
由于對功效和安全性有直接影響，因此必須清楚了解每個ADC的連接子。Biozen Intact XB-C8為確定ADC的載藥量分布和DAR提供了出色的工具。其大孔徑的特點允許完整的ADCs與中等保留的固定相相互作用，而核－殼顆粒則提供更高的柱效，為具有不同載藥量的ADC提供所需的分離度。
赫賽汀-vcMMAE，
使用Biozen 3.6μm Intact XB-C8
赫賽汀-mcMMAF，
使用Biozen 3.6μm Intact XB-C8
參考文獻：
[1]. Legeron R, Xuereb F, Chaignepain S, Gadeau A.P, Claverol S, Dupuy J.W, Djabarouti S, Couffinhal T, Schmitter J.M；Breilh D. A new reliable, transposable and cost-effective assay for absolute quantification of total plasmatic bevacizumab by LCMS/MS in human plasma comparing two internal standard calibration approaches. Journal of Chromatography B, 1070, 43–53(2017).
[2].?Marin, C.,?Khoudour, N.,?Millet, A.,Lebert, D., Bros, P., Thomas, F., Ternant, D., Lacarelle, B., Guitton, J.; Ciccolini, J.; et al. Cross-Validation of a Multiplex LC-MS/MS Method for Assaying mAbs Plasma Levels in Patients with Cancer: A GPCO-UNICANCER Study. Pharmaceuticals. 14, 796. (2021).
[3].?Van De Merbel, N. C., Olaleye, O., Spanov, B., Bischoff, R. Large molecule bioanalysis by LCMS: Beyond simply quantifying. Bioanalysis, 14(7), 397-400(2022).
[4].?Bronsema KJ, Bischoff R, van de Merbel NC. High-sensitivity LC–MS/MS quantification of peptides and proteins in complex biological samples: the impact of enzymatic digestion and internal standard selection on method performance. Anal. Chem. 85(20),9528–9535 (2013).
