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DMPK專欄 | 通過LC-MS/HRMS和LC-MS/MS定量人血漿中的納武利尤單抗（Nivolumab）
摘要
納武利尤單抗（Nivolumab）是一種全人免疫球蛋白 G4，用于治療幾種晚期實體癌，作為免疫檢查點抑制劑。血漿中 mAb 的定量存在一些挑戰，因為 IgG 固有地存在于復雜的生物基質中，這種測定必須基于可靠、選擇性、 和準確的分析方法。本研究描述了在兩個獨立實驗室中進行的兩種經過驗證的方法，一種是使用三重四極桿串聯質譜 (LC-MS/MS) 開發的，另一種是使用軌道阱系統 (LC-MS/HRMS) 開發的高分辨率質譜。兩種方法都使用全長穩定同位素標記的 nivolumab 樣（精氨酸 13C6-15N4 和賴氨酸 13C6-15N2）作為內標。樣品制備基于 IgG 免疫捕獲，然后進行胰蛋白酶消化，并以陽性模式定量一種替代肽。對于LC-MS/HRMS和 LC-MS/MS，測定分別在 5–100 μg/mL 和 5–150 μg/mL 范圍內顯示出良好的線性。LC-MS/HRMS 和 LC-MS/MS 的定量限分別設定為 2 和 5 μg/mL。兩種方法也獲得了可接受的準確度（從 - 13.6% 到 3.0%）和精密度（20% 以內）值。兩種 LC-MS 方法顯示出非常不同的基質效應，這與使用不同的分析柱和洗脫梯度有關。
關鍵詞：Nivolumab；LC-MS/HRMS ；LC-MS/MS；Strata X；
＋
樣品信息：用戶保密?
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實驗部分（儀器、試劑與材料）
1
主要儀器設備
UltiMate 3000 with Q-Exactive Plus Orbitrap (Thermo Scientific, Bremen, Germany)
Exion with 6500 QTRAP (Sciex, Framingham, U.S.A)
2
試劑材料
甲醇、乙腈、甲酸為質譜純；氨水為分析純；
Strata-X; 20 x 2.0 mm, 25 μm；
3
樣品預處理
Protein G板，板的每個孔都用 200 μL PBS(1X) 洗滌兩次，正壓或負壓去除 PBS。將 20 μL 血漿（標準品、質量控制、患者樣品）與 80 μL 含有 SIL-NIVO 樣（最終濃度 20 μg/mL）的 PBS (1X) 混合，并將混合物分布在板上。然后將板置于室溫下的定軌振蕩器上。孵育 1 小時后，用 200 μL PBS (1X) 洗滌樹脂 3 次。
4
樣品凈化
LC-MS/HRMS通過使用兩次 150 μL 洗脫緩沖液（水/乙腈，50/50，v/v，含 0.1% FA）進行洗脫，然后進行離心步驟（1000g，1 分鐘）。將兩個部分合并，然后在溫和的氮氣流下在室溫下干燥。殘留物用 45 μL 碳酸氫銨 (100 mM) 重懸，洗脫的 IgG 在 37°C 下用 2 μg 胰蛋白酶金消化 16 小時。加入 FA（終濃度為 1%）停止反應后，將樣品離心（5 分鐘，13 000 g），將 20 μL 澄清的上清液注入色譜裝置。
LC-MS/MS用于洗脫的緩沖液是水和乙腈的混合物（70/30，v/v，含 0.5% FA），在快速真空蒸發之前，先用 200 μL 進行兩步洗脫。用30 μL 胰蛋白酶消化液再懸浮。在 37°C 下過夜消化蛋白質。然后，將 20 μL 提取的樣品注入 LC-MS。
5
LC-MS/HRMS色譜條件
色譜柱：在線樣品凈化柱(Strata-X; 20 x 2.0 mm, 25 μm)
Luna Omega PS-C18 (100 × 2.1 mm, 1.6 μm)；
泵1：流動相0.1% FA水：0.1% FA乙腈 (95/5; v/v)
泵2：流動相A：0.1%甲酸水溶液；
? ? ? ? 流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；
流速：150 μL/min；
柱溫：30 ℃
進樣量：20 μL
流動相梯度：見表1
表1.流動相梯度表
時間 (min)
A%B%09558901091090
9.1
955129556
LC-MS/MS色譜條件
流動相A：0.1%甲酸水溶液；
流動相B：0.1%甲酸甲醇溶液；
色譜柱：Biozen XB-C18 (100 × 2.1 mm, 2.6 μm)；
流速：100 μL/min；
柱溫：40 ℃
進樣量：3 μL
流動相梯度：見表2
表2.流動相梯度表
時間 (min)
A%B%0
100
0
1.5
100
056535150
100
1900
19.1
100
029
100
0＋
實驗結果
結論：
?
對于LC-MS/HRMS和 LC-MS/MS，測定分別在 5–100 μg/mL 和 5–150 μg/mL 范圍內顯示出良好的線性。LC-MS/HRMS 和 LC-MS/MS 的定量限分別設定為 2 和 5 μg/mL。兩種方法也獲得了可接受的準確度（從 - 13.6% 到 3.0%）和精密度（20% 以內）值。
??
本文部分摘自：《Talanta》Quantification of nivolumab in human plasma by LC-MS/HRMS and LC-MS/MS, comparison with ELISA
https://doi.org/10.1016/j.talanta.2020.121889
