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還在手動計算嗎？|相對定量（比較Ct法）實驗計算介紹
在熒光定量PCR實驗中，相對定量方法適用于大多數基因表達研究。這種定量方法以穩定表達的內參基因作為參照，用于分析實驗樣本間目的基因表達水平變化。由于實驗設置簡單，比較Ct法是相對定量實驗中最常用的方法，實驗結束后，利用2-△△Ct算法即可對相對表達結果進行計算。在平時的交流溝通中，我們了解到，有些用戶利用qPCR軟件得到Ct值后，會手動進行相對定量的計算。其實，ABI的各種機型搭配實驗軟件，均可以直接給出相對定量的計算結果，這些結果與手動計算的結果是一致的，可以免去手動計算的過程。
今天我們利用ABI熒光定量軟件中比較Ct法的Sample數據，幫大家梳理一下比較Ct法的計算流程，幫助大家消除對軟件結果使用的疑慮。
一
比較Ct法的基本原理
我們先來回顧一下比較Ct法的基本原理，這個方法最早是KJ Livak（Applied Biosystems）在2001年發表的文章中提出的。我們將推導過程列在下圖，感興趣的小伙伴可以查看原文[1]。
圖1.比較Ct法相對定量的推導過程
需要注意的是，靶基因與內參基因的擴增效率一致，且接近于100%，是使用比較Ct法的前提。
二
比較Ct法相對定量結果計算
理解了原理之后，我們來看具體計算過程。在比較Ct法相對定量的實驗中，我們建議對于每個樣本，內參基因及目的基因都設置至少三個技術重復，以滿足實驗的統計學要求。根據比較Ct法的原理，我們對每個樣品分別計算出目的基因(GOI, Gene of Interest)及內參基因(Normalizer)的Ct均值，再將目的基因的Ct均值減去內參基因的Ct均值，即得到對于該樣品的ΔCt值。再將待測樣品的ΔCt值減去對照樣品的ΔCt值，得到最后用于計算相對表達的ΔΔCt值，公式如下：
了解了計算過程后，我們以QuantStudio?5熒光定量系統中的比較Ct法相對定量數據為例，利用QuantStudio Design&Analysis Desktop Software來演示上述計算過程。
圖2.QuantStudio Design&Analysis Desktop?Software中相對定量Sample數據擴增曲線
將Ct值整理至下表。這里指定樣品400為對照樣本，基因IPC為內參基因。
表1.QuantStudio Design&Analysis Desktop?Software中相對定量Sample數據Ct值整理
我們按照公式進行手動計算，首先依次計算三個樣本中內參基因IPC及目的基因RNaseP的Ct均值，進而算得每個樣本的ΔCt值。
表2.相對定量Sample數據各樣本ΔCt值的計算
接下來根據得到的每個樣本的ΔCt值，以樣本400為對照樣本，可以得到樣本1600的ΔΔCt=(-2.363)-(-0.489)=-1.874，樣品800樣本的ΔΔCt=(-1.255)-(-0.489)=-0.766。最后利用2-△△Ct算法，得到每個樣本中RNaseP基因相對于樣本400的表達量如下表。
表3.相對定量Sample數據各樣本ΔΔCt值及相對表達量的計算
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那么如果用軟件直接計算，得出結果是什么呢？我們可以在Results界面下切換至Gene Expression選項，查看比較Ct法相對定量的結果。
圖3.QuantStudio Design&Analysis Desktop?Software中Sample數據相對定量結果的計算
可以看到軟件的計算結果與手動計算的結果是一致的，并且可以找到計算過程中的中間量，如μ(Ct)，各樣本的ΔCt值及ΔΔCt值。
三
相對定量上下限（RQ min?and?RQ max）的計算
由于實驗設置了重復，我們還需要對相對定量值添加上下限，定量PCR軟件對上下限的計算給出了兩種算法。默認的算法是置信區間算法（Confidence Level Algorithm），這種算法基于實驗中Ct值的統計學分布進行的區間估計。另一種可供選擇的方法是基于標準差的算法（Standard Deviation Algorithm），這種方法計算相對簡單，只需要計算出ΔΔCt的標準差值，是早期相對定量分析中提出的算法（KJ Livak,& TD Schmittgen, 2001）。我們分別來看這兩種方法的計算上下限的過程。
首先來看置信區間算法，這里還是以剛才用到的比較Ct相對定量數據為例。該方法的細節推導詳見文末的參考文獻[2]，這里只展示計算的過程。
首先我們需要分別對每個樣本中的目的基因和內參基因的Ct值都計算標準差，計算公式如下：
對每個樣本，利用計算得到的目的基因和內參基因的標準差，進一步計算ΔCt的標準誤差（ΔCtSE），公式如下：
其中，n1和n2是每個樣本中靶基因和內參基因的復孔數目。
計算過程還需要用到給定置信區間下的t值，在靶基因與內參基因的復孔數均大于2的情況下，可以通過下式計算自由度:
-ΔΔCt置信水平為1-α的置信區間為
-?ΔΔCt±tα/2(ν(ΔCt))× ΔCt?SE
以常用的置信水平95%為例，對于本例中的樣本，靶基因與內參基因的復孔數均為3，自由度即為ν(ΔCt)=3+3-2=4，需要計算t0.05/2(4)，可在Excel中由公式TINV(0.05, 4)給出，為2.776。依次計算上述各數值，最后得到RQ Min和RQ Max整理至下表：
?表4.置信區間法相對定量上下限結果計算??
在軟件中，查看基于置信區間的上下限結果，可以看到，計算結果與上述計算一致。
圖4.軟件中置信區間法相對定量上下限結果計算
接下來是基于ΔΔCt的標準差的上下限計算。上述計算中，我們已經完成了每個樣本中內參基因與目的基因的標準差計算。對于每個樣本，由于ΔCt的計算需要同時用到目的基因和內參基因Ct值的均值，其標準差需要把內參基因和目的基因Ct的標準差同時考慮進來，這里以樣本800為例，按下式計算：
計算ΔΔCt值時，由于直接使用了對照樣品的ΔCt，認為其為一個固定數值，故認為對于單個實驗樣本，其ΔΔCt的標準差與ΔCt的標準差相等，如對樣本800，有：
根據計算結果，對于每個樣品，ΔΔCt值正負一個標準差值作為其上下限。以樣品800為例，ΔΔCt,800為-0.766， 標準差為0.059，ΔΔCt,800的上下限為-0.766±0.059，可得到上限RQ Max對應的ΔΔCt值為-0.825，下限RQ Min對應的ΔΔCt為-0.707。利用2-ΔΔCt算法，算得RQ Max為1.771，RQ Min為1.632。利用相似的計算過程，可以完成對樣品400及樣本1600中RQ Max和RQ Min的計算，計算結果如下表：
表5.基于標準差的相對定量上下限結果計算
若在軟件中查看這種算法的上下限結果，我們可以查看Analysis->Analysis Settings->Relative Quantification Settings下的RQ Min/Max Calculations選項，并將默認的Confidence Level選項改為Standard Deviations，上下限默認一個標準差，勾選1，如下圖所示：
圖5.QuantStudio Design&Analysis Desktop?Software相對定量設置
回到Results界面下Relative Expression選項，查看軟件給出的結果，上下限的計算結果與上述手動計算的結果一致。? ? ? ? ??
圖6.軟件中基于標準差的相對定量上下限結果計算
小結
通過今天的文章，我們幫大家梳理了比較Ct法進行相對定量實驗的原理以及計算方法。可以看到，根據指定的內參基因及對照樣本，不管是基因表達相對定量值還是其上下限，軟件給出的計算結果與文獻中提出的計算方法都是一致的，因此無需再進行復雜的手動計算。在平時的實驗中，只需在軟件中正確設置對照樣本與內參基因，即可直接使用軟件給出的結果，用于后續的數據分析及作圖。
參考文獻：
1. Livak, K. J., & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2? ΔΔCT method. methods, 25(4), 402-408.
2. User Bulletin: Applied Biosystems Real-Time PCR Systems - Relative Quantification (RQ) Algorithms in Applied Biosystems Real-Time PCR Systems Software. July 2007, Part Number 4378622.
