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有關(guān)保留時間
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保留時間
保留時間異常漂移的幾種最常見的原因
色譜柱平衡
首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10-20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑（如離子對試劑）則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。
如果你在使用未修飾的硅膠柱做正相色譜，那么這是最可能發(fā)生的問題。正相色譜的保留時間容易受到硅膠表面吸附的水含量的影響，然后是溶解在流動相中的水的作用。因為水在正己烷或二氯甲烷等試劑中的溶解度非常低，所以色譜柱平衡需要很長時間。通常解決硅膠和水的平衡問題的辦法就是使用與水“半飽和”的試劑。制備方法是把1體積的疏水試劑用水飽和后，再與相同體積的“干燥”試劑混合。這個方法可以極大的加快平衡時間。
流路系統(tǒng)異常
流路系統(tǒng)的異常分為兩種情況，保留時間的漂移有可能是流路系統(tǒng)有漏泄導(dǎo)致的，需要檢查流路系統(tǒng)的各連接部件以及泵的密封是否正常。除此之外，還有流動泵頭發(fā)生的氣阻，導(dǎo)致保留時間隨機的漂移，往往要么是保留時間延遲，要么是保留時間提前。為了防止泵頭的氣阻發(fā)生，對流動相的脫氣是非常必要的。
流動相組成或污染
流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等。如果你沒有使用儀器的在線混合裝置，那么流動相的組分可能在緩慢的蒸發(fā)。當(dāng)你用氦氣流噴射流動相的方法趕氣泡的時候，你必須控制噴射的速率最小。?
流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分。
在極個別的情況下，如果樣品溶液與流動相不相容，也有可能會導(dǎo)致保留時間的漂移，很好理解，樣品在進樣的時候，并沒有達到溶解平衡的狀態(tài)，自然會導(dǎo)致峰型的異常（比如峰的分裂）以及保留時間的不一致。
固定相穩(wěn)定性
固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。要保持固定相的水解穩(wěn)定性，最好是在中性PH值，低溫下PH3-5左右，等度條件好于梯度條件。當(dāng)?shù)榷葪l件下發(fā)生水解時，鍵合相通常會自我吸附，達成一種區(qū)域平衡。然而，在使用高濃度的有機溶劑時，例如在梯度洗脫或者沖洗色譜柱的過程中，這種平衡被打破，鍵合相會被沖洗出色譜柱。水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩(wěn)定；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。
經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。
色譜柱污染
污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。
樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。如：配藥中的賦形劑，生化樣品（如血清）中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加。可以通過使用固相提取（SPE）等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。
避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。
疏水坍塌
當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現(xiàn)用含大量有機組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進行平衡。由是色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團的反相色譜柱或非端基封口的色譜柱也可避免發(fā)生坍塌。
樣品成分的誘導(dǎo)作用
如果樣品中含有大共軛體系化合物，可以形成較強的π-π鍵，在較大的化合物比例下，量較少的成分被量大的成分所誘導(dǎo)，削弱了化合物于色譜柱之間的作用力，從而減弱了色譜柱的篩選作用導(dǎo)致保留時間漂移。
溫度變化
如果你的樣品是自動分析過夜或者過了周末的，那么你得到的保留時間漂移的結(jié)果可能和實驗室溫度變化有關(guān)。在許多地方，室溫的設(shè)置在晚上或者周末通常是不一樣的。通常來講，1℃的變化導(dǎo)致保留時間漂移大約1%到2%
保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：即保留時間漂移和保留時間波動。前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時間無固定規(guī)律的波動。將此兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因往往很有幫助。如保留時間漂移的多半原因是不同機理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解），色譜柱污染（由樣品或流動相所致）等，而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。
the end
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