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淺談時間分辨熒光技術(shù)
前言
時間分辨熒光（Time-Resolved Fluorescence，TRF）技術(shù)近年來使用范圍日趨廣泛，其技術(shù)原理最早可追溯至獲得 1967 年諾貝爾化學(xué)獎的“閃光光解技術(shù)”。與傳統(tǒng)熒光檢測方法相比，TRF 有著靈敏度高、樣品制備簡單、檢測重復(fù)性好的優(yōu)點[1]，因此衍生出不少基于 TRF 的新興技術(shù)。
熒光壽命是一種分子性質(zhì)，通常與熒光團(tuán)濃度、激發(fā)光強度等條件無關(guān)，而與其自身結(jié)構(gòu)和所處的微環(huán)境，例如溫度、極性、pH 值等有關(guān)，時間分辨熒光（TRF）檢測技術(shù)正是利用該性質(zhì)，在熒光壽命維度來區(qū)分樣品信號。常規(guī)的 TRF 技術(shù)有兩條主要技術(shù)路線，分別是熒光壽命成像（Fluorescence Lifetime Imaging，F(xiàn)LIM）技術(shù)和時間分辨熒光免疫分析（Time-Resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）技術(shù)。
熒光壽命成像 FLIM 技術(shù)于 1989 年首次由 I. Bugiel 等人[2]報道，利用亞納秒時間分辨熒光激光掃描顯微鏡成功實現(xiàn)了細(xì)胞水平的研究。近幾十年該技術(shù)發(fā)展出了以 CCD 相機或者超高速相機為基礎(chǔ)的寬場成像和以脈沖激光為基礎(chǔ)的共聚焦成像兩大類，并基于時域和頻域的原理形成了多種 FLIM 技術(shù)，但均擁有鮮明的優(yōu)缺點。除結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致的系統(tǒng)搭建難度較大以外，要么分辨率和信噪比較高但難以測量動態(tài)樣品，要么采集速度快但對樣品信號強度有要求。市面上成熟的商業(yè)化方案也較少，Leica Microsystem 推出的 FALCON 熒光壽命成像系統(tǒng)為其代表。
時間分辨熒光免疫分析 TRFIA 技術(shù)則是將時間分辨熒光與免疫分析技術(shù)相結(jié)合，屬于一類非放射性標(biāo)記技術(shù)。TRFIA 以三價鑭系元素離子或其螯合物，例如銪（Eu）、鋱（Tb）、釤（Sm）和鏑（Dy）為標(biāo)記物，來代替常用的熒光物質(zhì)對抗原抗體進(jìn)行標(biāo)記，并使用帶有時間分辨熒光檢測功能的儀器如酶標(biāo)儀來對熒光強度信號進(jìn)行檢測，最終繪制標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線，定量分析待測物的濃度。
圖1?時間分辨熒光免疫分析技術(shù)基本原理
對一些常見的熒光基團(tuán)來說，其熒光壽命普遍處于 10-100 ns 左右，而鑭系元素及其螯合物的熒光壽命可達(dá) 103-106?ns，因此在檢測信號時（圖 1），利用兩次激發(fā)光脈沖的間隔，等待雜散信號的壽命衰減之后再進(jìn)行熒光強度的檢測，可以大大減少其他信號的干擾，提高信噪比和靈敏度。
在稀土元素的選擇上，銪的三價離子（Eu3+）在生物研究領(lǐng)域最為常用，其熒光壽命約 1ms，激發(fā)光波長通常在 330nm 左右，發(fā)射光波長通常在 610nm 左右，引入適當(dāng)?shù)呐浜衔锵到y(tǒng)以后，能使銪在水溶液中更加穩(wěn)定，并且熒光強度可增強數(shù)十倍[3]。而鋱的三價離子（Tb3+）配合物的激發(fā)光波長通常在 290nm 左右，發(fā)射光波長通常在 540nm 左右，該發(fā)射光波段處于許多常見生物熒光基團(tuán)的波段范圍內(nèi)，且熱動力學(xué)穩(wěn)定性較差，并具有一定的細(xì)胞毒性，因此與銪離子相比在生物領(lǐng)域使用略少，但在材料學(xué)領(lǐng)域使用前景廣闊。此外釤（Sm3+）也偶有應(yīng)用，比如銪與釤的雙標(biāo)記。
隨著 TRFIA 的應(yīng)用逐漸廣泛，其中一類衍生技術(shù)也逐漸被大家所熟知，即均相時間分辨熒光 HTRF （Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）。該技術(shù)將時間分辨熒光 TRF 和熒光共振能量轉(zhuǎn)移 FRET 相結(jié)合，使用銪（Eu3+）或鋱（Lumi4 - Tb）的穴狀化合物作為供體，熒光團(tuán)（ XL665 或小分子 d2 ）作為受體[4]。當(dāng)供體和受體距離足夠近時，供體被一個能量源激發(fā)，可以引發(fā)能量轉(zhuǎn)移到受體，使其在特定波長發(fā)出熒光，用于檢測生物分子之間的相互作用。
Molecular Devices 公司旗下 M 系列、iD5、i3x、Paradigm 等多款型號的多功能酶標(biāo)儀均可配備 TRF 檢測功能，并提供經(jīng) Cisbio 認(rèn)證的 HTRF 功能模塊可供選擇，獲得高靈敏度和寬動態(tài)范圍的數(shù)據(jù)。
綜上所述
TRF 技術(shù)已經(jīng)逐步發(fā)展成熟，并擴展出了諸多使用方向，拓展了研究人員的工具庫，相信未來此類技術(shù)一定會得到更加廣泛的應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)：
[1] 李振甲, 陳泮藻, 高 平. 時間分辨熒光免疫分析技術(shù)
與應(yīng)用[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1996. 16~31
[2] I. Bugiel, K. K¨onig and H. Wabnitz, Investigation of cells by
fluorescence laser scanning microscopy with subnanosecond time resolution, Lasers Life Sci., 1989, 3, 47–53.
[3] 戚玉華，許崇娟，趙洪光，等．?镥對銪-諾氟沙星體系
的熒光增強效應(yīng)［J］． 濟(jì)南大學(xué)學(xué)報( 自然科學(xué)版) ，
[4] https://www.cisbio.net/content/htrf-technology-basics
關(guān)于美谷分子儀器
Molecular Devices 始創(chuàng)于上世紀(jì) 80 年代美國硅谷，并在全球設(shè)有多個代表處和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海設(shè)立了中國代表處，2010 年加入全球科學(xué)與技術(shù)的創(chuàng)新者丹納赫集團(tuán)，2011 年正式成立商務(wù)公司：美谷分子儀器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持續(xù)創(chuàng)新、快速高效、高性能的產(chǎn)品及完善的售后服務(wù)著稱業(yè)內(nèi)，我們一直致力于為客戶提供在生命科學(xué)研究、制藥及生物治療開發(fā)等領(lǐng)域蛋白和細(xì)胞生物學(xué)的創(chuàng)新性生物分析解決方案。
