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抗體藥物生物學活性檢測的ELISA高通量方法

美谷分子儀器

2021.10.08

抗體藥物的主要作用機制是通過 Fab 區與疾病相關的靶細胞抗原發生特異性結合，再通過 Fc 區發揮一系列的效應功能，包括 Fc 區域通過結合主要是 NK 細胞上的 FcγRIII（CD16A）引發抗體依賴細胞介導的吞噬作用（ADCC）；與血清補體分子（C1q）結合，繼而形成膜攻擊復合物（MAC）引發補體依賴的細胞毒作用（CDC）；與巨噬細胞上的 FcγRIII（CD16A），FcγRII（CD32A）和 FcγRI（CD64）結合，可引發抗體依賴細胞介導的吞噬作用（ADCP），進而起到治療的作用。有結合才會有功能，有功能一定有結合，結合和功能是抗體活性檢測中最重要的兩部分，所以在生物藥前期研發階段，包括細胞系建立的階段，需要對抗體類藥物的活性進行測定，以確保抗體類藥物的有效性。

Mécanismes d’action et toxicités potentielles?

des anticorps monoclonaux

Med Sci (Paris) 2019 ; 35: 1114–1120

一般用親和力來表示抗體與靶點分子結合的情況，它是可逆反應過程中抗原、抗體和抗原-抗體復合物之間的相對狀態的特征參數。對于抗體藥物的效應功能測定，一般是基于細胞功能的檢測，如檢測細胞信號轉導過程中關鍵生物標記物的信號；對引起細胞應答的轉錄和翻譯水平的測定；以整個細胞為對象測定細胞的增殖或者死亡。

ELISA 和流式細胞術是目前檢測抗體活性中常用的兩種方法。如 ELISA 檢測抗原抗體結合親和力，一般將抗體與系列稀釋的抗原一同在溶液中溫育，進行抗原-抗體反應。當反應達到平衡后，將溶液移至包被有相同固相抗原的聚苯乙烯微板中，進行接下來的酶標二抗的孵育和顯色。測得的 OD 值結合梯度稀釋的抗原濃度繪制擬合曲線，最終找到最強信號一半的點，通過 IC50?值評價抗體的抗原結合能力。

ELISA 的主要操作步驟

但是 ELISA 步驟繁多，有大量的移液、清洗步驟，靠人工操作，難免會出現移液體積不準、漏加等人工操作誤差導致的信號弱或者過飽和，以及標準曲線線性不佳、污染等問題。丹納赫生命科學擁有自動化工作站結合酶標儀的整合方案，可以自動化地對樣本進行高通量的 ELISA 操作，最大程度避免實驗誤差及重復的人工勞動。

自動化工作站進行 ELISA 實驗流程

自動化工作站進行 ELISA 實驗的結果

另外，還可以利用酶標儀的熒光偏振（FP）功能結合 ValitaTiTER 試劑實現快速、均相、精確地對 IgG Fc 結合產量進行有效評價。熒光偏振是一項廣泛用于監測不斷變化的結合事件的技術，可用于評估包括蛋白-抗體結合和 DNA 雜交在內的生物分子相互作用以及酶活性。通過平面偏振光激發的熒光標記小分子（示蹤劑）可發射消偏振程度最高的光，這是因為示蹤劑在激發與發射之間的間隔時間里快速減少。但當示蹤劑結合一個比之大得多的分子時，它的旋轉速度就會變慢，同時發射光仍然有大部分產生偏振。

在 96 孔微滴度板的每個孔中，都包被有熒光標記的 IgG 結合多肽蛋白 G。當加入樣品到孔板中時，蛋白 G 分子被重懸并發生結合。一旦結合抗體，蛋白 G 分子的運動速率便會下降，導致熒光偏振?( FP ) 值的增加。