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腫瘤疫苗生物學(xué)活性評估
腫瘤疫苗背景
腫瘤疫苗，是一種具有預(yù)防和治療潛力的有吸引力的替代免疫治療選擇，是近年研究的熱點之一。針對腫瘤相關(guān)抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或腫瘤特異性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特異性地攻擊和破壞抗原過表達的惡性細(xì)胞，并由于免疫記憶而實現(xiàn)慢性治療反應(yīng)。因此，與其他免疫療法相比，癌癥疫苗提供了特異性、安全性和可耐受的治療。
根據(jù)腫瘤抗原的組分，癌癥疫苗大致可以分為四種類型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫細(xì)胞的疫苗。FDA 批準(zhǔn)的首個個性化腫瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一種基于免疫細(xì)胞的疫苗，用于激素難治性前列腺癌的治療。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的腫瘤疫苗。
圖 1 腫瘤疫苗抗原呈遞平臺示意圖
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腫瘤疫苗有效性評估方法
生物體接種疫苗后，腫瘤抗原被帶到淋巴結(jié)，進而激活抗原特異性的 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞，活化的 B 細(xì)胞產(chǎn)生的抗體及活化的效應(yīng) T 細(xì)胞會使腫瘤內(nèi)脹并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。
圖 2 腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)示意圖
如何有效的評估腫瘤疫苗的有效性是一個非常值得探討的問題，常用的腫瘤疫苗有效性驗證的方法，包括細(xì)胞因子檢測、CTL 活性檢測、T 細(xì)胞活化標(biāo)志物檢測、抗體滴度檢測、ADCC 檢測等。
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細(xì)胞因子檢測
細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞經(jīng)過刺激而合成并分泌的小分子蛋白質(zhì)，在免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用，因此可以通過細(xì)胞因子的分泌能力來反應(yīng)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫的水平。常見的細(xì)胞因子有白介素 (IL) 、干擾素 (IFN)、 腫瘤壞死因子 (TNF) 等。下面比較了幾種常見的檢測方法。
ELISA 是一種非常經(jīng)典的細(xì)胞因子的檢測方法，例如在王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法檢測接種疫苗后小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞（BMDCs）分泌細(xì)胞因子的能力，檢測方法如下：
BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng) 6 天，然后以每孔 5×104 細(xì)胞的密度在 96 孔板中接種。以 5μM 或 10μM 的最終濃度加入疫苗抗原，孵育 24 小時。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 試劑組定量培養(yǎng)上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕獲抗體包被 ELISA 板過夜，然后在室溫下依次加入阻斷液、細(xì)胞培養(yǎng)上清和檢測抗體，孵育 1h 。最后加入終止液和顯色劑，用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。
檢測結(jié)果如下：
從檢測結(jié)果可以看出，T7（TLR7 激動劑）的存在可以顯著提升 ML/MB 抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
圖 3 ELISA 法測定小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞 (BMDCs) 分泌
TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平
Ankita Leekha 等人發(fā)表的關(guān)于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法評估細(xì)胞因子的分泌水平，可以作為參考。具體方法如下：
從小鼠中分離脾細(xì)胞和肺細(xì)胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基礎(chǔ)試劑盒和小鼠 IL4 ELISpot 基礎(chǔ)試劑盒 (Mabtech, VA, USA) 進行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 檢測。在 37℃ 下，在預(yù)包被抗體的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾細(xì)胞和肺細(xì)胞，培養(yǎng) 16-18 小時。第二天，洗掉細(xì)胞，加入生物素化的檢測抗體。洗板后，加入 1:30000 稀釋的 Extravidi-ALP 偶聯(lián)物，室溫孵育 1 小時。洗板后，每孔添加 70μL 顯色液，孵育 20-30min，形成斑點，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 對斑點進行量化。每個點對應(yīng)一個單獨的細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。
檢測結(jié)果如下：
圖 4 ELIPSOT 方法檢測小鼠脾細(xì)胞
和肺細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平
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CTL 活性檢測
疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 (CTL) 可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，起到抗腫瘤的作用，因此可以通過檢測 CTL 的殺傷效應(yīng)來反應(yīng)疫苗的效果。常用的檢測細(xì)殺傷效應(yīng)的方法有很多，下表列舉了一些常用的方法。
王曉東等人發(fā)表的文章中提到了 LDH 檢測，檢測方法如下：
從接種疫苗小鼠的脾臟中分離淋巴細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）。EAC 腫瘤細(xì)胞（靶細(xì)胞）與淋巴細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞比例為 50:1）共培養(yǎng) 4h，使用乳酸脫氫 (LDH) 法測定細(xì)胞毒性。將培養(yǎng) 4h 后的培養(yǎng)上清加入在 ELISA 板中，室溫下加入底物溶液，孵育 30min。最后，加入終止液終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 490nm 處檢測光密度。
檢測結(jié)果如下：
相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組 CTL 細(xì)胞具有顯著的殺傷效應(yīng)。
圖 5 LDH 法測定 CTL 介導(dǎo)的 EAC 靶細(xì)胞的裂解水平
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抗體滴度及親和力檢測
腫瘤疫苗除了可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫之外，也可誘導(dǎo)體液免疫，對此可通過對抗體滴度及親和力進行檢測來反應(yīng)疫苗抗腫瘤的效果，ELISA 是一種非常經(jīng)典的檢測方法。
上述關(guān)于胃癌疫苗的文章中通過 ELISA 方法測定小鼠接種疫苗后血清中總 IgG 含量，具體檢測過程如下：
小鼠接種疫苗后收集血液樣本，通過 3000g 離心 15 分鐘獲得血清樣本。ELISA 板預(yù)先在 4℃ 包被 BSA-MG1 過夜，然后在室溫下依次加載封閉溶液 2h，血清樣品 (1:50 稀釋) 和檢測抗體 1h。最后，在體系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和終止液，用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 405nm 處記錄 OD 值。
檢測結(jié)果如下：
相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組抗體含量明顯上升。
圖6 ELISA法測定疫苗誘導(dǎo)的血清抗體水平
除此之外，在 Emily C. Gale 等人發(fā)表的關(guān)于 mRNA 遞送系統(tǒng)及輔劑研究的文章中，通過 ELISA?的方法測定了 mRNA OVA 模式疫苗誘導(dǎo)的 OVA 特異性抗體的絕對含量及其親和力。具體檢測方法如下：
抗體濃度：小鼠接種加強疫苗后，采集血液樣品，血清按照 1:100 000 進行稀釋。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 試劑，按照試劑廠家的說明進行 ELISA 實驗。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清抗體濃度，表示 mg/mL。
抗體親和性：將 12 個梯度稀釋的血清與恒定濃度標(biāo)記 HRP 的 anti-OVA 抗體 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室溫孵育 2 小時，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反應(yīng)。測定 450nm 處的 OD 值。根據(jù)業(yè)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體的共同親和力，假設(shè)對照抗體的 KD 為 1nM 對實驗組的 KD 值進行統(tǒng)計。這一假設(shè)僅影響報告的絕對 KD 值，而不影響實驗組之間的相對差異。
檢測結(jié)果如下：
pIC 為雙鏈 RNA 結(jié)構(gòu)模擬物，圖E中比較了可溶性的 pIC 和不同納米顆粒遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)的絕對抗體含量，從圖 E 中可以看出 2B 遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)的 OVA 特異性抗體含量最高。從F和G可以看出 2B 遞送系統(tǒng)相對于可溶性 pIC 來說誘導(dǎo)的 IgG 親和力也顯著升高。
圖 7 pIC/PBAE NPs 增強體液免疫
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ADCC 檢測
疫苗誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生的抗體能夠捕捉目標(biāo)抗原，阻斷這個靶分子的功能，也可以引導(dǎo)其他免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）殺死表達抗原的靶細(xì)胞，在腫瘤治療中，特別是血液腫瘤中，抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 (ADCC) 起著關(guān)鍵作用，ADCC 常用的檢測方法包括細(xì)胞活力檢測、LDH 檢測、工程細(xì)胞株、Delfia、RTCA、細(xì)胞成像檢測等。
王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法檢測 ADCC，檢測方法如下：
小鼠接種疫苗后，采集其血清樣本（1:25 稀釋），然后與 EAC 細(xì)胞（靶細(xì)胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 細(xì)胞分離試劑盒從正常 BALB/c 小鼠中分離出自然殺傷 (NK) 細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞），與抗體標(biāo)記的 EAC 細(xì)胞以效靶比 50:1 共培養(yǎng) 4 小時。采用 LDH 法 (Promega) 測定細(xì)胞毒性，檢測方法與之前提到的 CTL 活性檢測的方法一致。
檢測結(jié)果如下：
相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組產(chǎn)生的抗體具有顯著的殺傷效應(yīng)。
圖 8 LDH 法測定血清抗體介導(dǎo)的 EAC 靶細(xì)胞的裂解水平
腫瘤疫苗生物學(xué)活性檢測解決方案推薦
本文介紹了腫瘤疫苗活性檢測的常用方法，包括細(xì)胞因子檢測、CTL 活性檢測、抗體滴度及親和力檢測、ADCC 檢測等方法，涉及到了酶標(biāo)儀、成像系統(tǒng)、流式、RTCA、洗板分液系統(tǒng)等設(shè)備。Agilent 細(xì)胞分析事業(yè)部可以從多個角度為用戶提供從樣品處理，到結(jié)果檢測再到數(shù)據(jù)分析的全面解決方案。
圖 9 Agilent 細(xì)胞分析部門一站式解決方案
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關(guān)于 BioTek
BioTek 是世界領(lǐng)先的多功能微孔板檢測儀及軟件的研發(fā)生產(chǎn)公司，擁有 54 年的悠久歷史。BioTek 的 Synergy 系列多功能微孔板檢測儀擁有靈活的功能配置和優(yōu)異的檢測結(jié)果，配合友好強大的操作軟件，為廣大用戶提供了便捷高效的使用體驗。服務(wù)科學(xué)，促進科學(xué)始終是我們追求的目標(biāo)。2019 年 BioTek 加入安捷倫科技有限公司，成為細(xì)胞分析事業(yè)部的重要組成成員。
關(guān)于安捷倫
安捷倫科技有限公司（紐約證交所：A）是生命科學(xué)、診斷和應(yīng)用化學(xué)市場領(lǐng)域的全球領(lǐng)導(dǎo)者，致力于為提升人類生活品質(zhì)提供敏銳洞察和創(chuàng)新經(jīng)驗。安捷倫的儀器、軟件、服務(wù)、解決方案和專家能夠為客戶最具挑戰(zhàn)性的難題提供更可靠的答案。2022 財年，安捷倫營業(yè)收入為 68.5 億美元，全球員工數(shù)約為 18,000 人。
