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新藥研發中HCP那些事（上）
繼《我不是藥神》熱播，制藥行業成為了大眾熱點。制藥行業本身是一個高投入、長周期、高風險的行業，讓我們且行且珍惜。今天，小編來介紹下關于新藥研發中宿主細胞蛋白（HCPs，Host Cell Proteins）的那些事兒。
宿主細胞是生產諸如重組蛋白、抗體和疫苗類藥物的上游材料，不同用途的藥物會采用不同的宿主細胞，重組蛋白類藥物常用的細胞有中國倉鼠卵巢細胞（CHO），新型疫苗常采用非洲綠猴腎細胞（Vero）、犬腎細胞 （MDCK）、昆蟲細胞、人二倍體細胞，傳統疫苗還會采用大腸桿菌、雞胚等作為宿主細胞。
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非生物類的小朋友們，可能被隔著屏幕的名稱惡心到了吧。
別太介意，更惡心的，小編還沒放呢！
宿主細胞蛋白如果殘留在藥物制劑中，會引起人體的免疫應答——過敏反應，如：發熱、水腫，甚至休克等。人體的免疫應答性質和效果，會受到HCPs的濃度、數量和個體免疫系統差異影響而不同。藥物監管部門最關注患者用藥的安全性，所以HCPs的監控變得越來越重要。作為藥企來說，藥物研發周期很長，成功率也很低，投入和產出不是直接劃等號的，因此在藥品研發的中后期，藥企也會非常關注生產工藝設計過程中HCPs的控制。因為，藥物中HCPs殘留量會影響臨床試驗效果，國外曾有報道，由于藥企開發的新藥在臨床實驗中出現免疫反應，導致臨床實驗推遲、擱置或重新設計工藝，如：易普森公司，凝血因子9(IB1001) 臨床實驗在2012年被擱置，2017才獲批。
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藥品即使被成功開發，但如果想進入不同國家的市場，還要達到當地藥物監管部門的標準，所以藥企都會遵照不同國家藥典要求，嚴格建立HCP監控體系。中華人民共和國藥典2010年版第三部就明確規定CHO細胞殘余蛋白占總蛋白含量要小于0.05%以下；對Vero細胞殘余蛋白會隨不同產品而異，ELISA方法檢測法每個劑量不高于2微克或4微克。美國FDA認為可以接受的范圍為1-100/100萬，即1-100個PPM。
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當前，廣泛被使用于HCP檢測的方法是雙抗體夾心酶聯免疫法（ELISA）。在藥物研發中，通常會建立通用和專屬的HCP ELISA方法。前期可以采用通用HCP ELISA試劑盒。到臨床實驗時，藥企會采用專屬試劑盒，即工藝特異HCP ELISA試劑盒，需要單獨純化HCP蛋白，免疫篩選抗體。
HCP ELISA的原理是先將HCP抗體包被酶標板，孵育待測樣品，通過HCP抗體捕獲和富集樣品中HCPs，再加入與包被酶標板的抗體種屬不同的，酶聯報告基團的HCP抗體，結合已被富集的HCPs，通過底物顯色或熒光的方式成像，最終定量計算HCPs。
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HCP ELISA的方法具有特異性強、靈敏度高、通量大和使用方便等特點，但也存在風險：
?ELISA方法能夠富集的HCPs至少要具有兩個及以上的表位。
當兩個表位被抗體結合時，不能存在空間位阻。
ELISA酶標板包被的抗體結合量低，會限制HCP檢出限。
不是所有HCPs都可以作為抗原產生抗體，因此會有“漏檢”，所以需要評估HCP ELISA抗體的覆蓋率（Coverage）。
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HCP ELISA抗體覆蓋率的評估方法一般會采用雙向電泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）和蛋白質免疫印跡（Western Blot，WB）技術結合的辦法。
首先，雙向電泳是利用蛋白質的等電點和分子量的微小差異，在凝膠內進行分離，一塊凝膠只能實現一個生物樣本的分離，HCPs在膠內會形成許多獨立的膠點。一個樣本至少要準備兩塊重復凝膠，電泳后，將凝膠從玻璃板中取出一塊凝膠直接用于HCPs總蛋白的染色成像，另一塊凝膠進行化學發光免疫印跡操作：轉膜、封閉、抗體孵育、洗膜，加入發光液后，拍照成像。最后，將分別得到的HCPs總蛋白分離圖像和HCP抗體結合的圖像放在一起疊加、匹配膠點、分別記錄匹配和未匹配的膠點數量，計算覆蓋率結果。
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如果上述的過程一切順利，那代表了詩和遠方。
這種普通雙向電泳與化學發光蛋白質免疫印跡組合的方法,由于化學發光成像和總蛋白的染色成像，并不是同一塊凝膠的結果，凝膠間差異和凝膠扭曲形變，無法自動修正，因此會導致膠點匹配難度大，大多數同行就是在這個環節累吐的。
接下來給大家介紹個新方法——熒光差異印跡電泳技術（DIBE，Differential In Blot Electrophoresis）。美國藥典（United States Pharmacopeia ，USP）的 [1132] Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals 和歐盟藥典 （European Pharmacopoeia 9.1）中2.6.34 HOST-PROTEIN CELL ASSAYS 中，都推薦使用差異熒光電泳技術（DIGE/DIBE），作為表征HCPs抗體覆蓋率的新方法。
差異熒光印跡電泳技術可以實現一個樣本，只需制備一塊凝膠，最終在同一張印跡膜上，展示兩個熒光通道，一個是HCPs總蛋白，另一個被抗體識別覆蓋的HCPs。DIGE/DIBE技術避免了膠間差異和凝膠形變，配合HCP專用分析軟件，自動膠點匹配，2D/3D全程跟蹤式顯示匹配效果，并且直接計算覆蓋率結果。
下期預告：
新藥研發中HCP那些事（下）
差異熒光印跡電泳技術的工作原理、膠點匹配流程和HCP Coverage的計算方法。
