體細(xì)胞突變對胚胎發(fā)育的分化過程進(jìn)行新的探究和定義
胚胎發(fā)育過程中人體造血系統(tǒng)發(fā)育在以前主要是通過顯微鏡觀察來確定的。
近日，來自英國韋爾科姆基金會桑格學(xué)院研究所的Ana Cvejic研究組與Peter J. Campbell研究組合作在Nature雜志上發(fā)表題為Lineage tracing of human development through somatic mutations的文章，利用體細(xì)胞突變對人類造血系統(tǒng)的發(fā)育過程進(jìn)行譜系追蹤，對胚胎發(fā)育的分化過程的不同階段進(jìn)行了新的探究和定義。
人類胚胎發(fā)育始于受精卵分裂為卵裂球，然后形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步分化為上胚層（Epiblast）和下胚層（Hypoblast）。下胚層被認(rèn)為主要產(chǎn)生胚外組織，而上胚層形成三個胚層：產(chǎn)生表皮和神經(jīng)系統(tǒng)外胚層（Ectoderm），產(chǎn)生心臟、腎臟、肌肉和結(jié)締組織的中胚層（Mesoderm）以及產(chǎn)生肺部和消化道的組成部分的內(nèi)胚層（Endoderm）。造血系統(tǒng)細(xì)胞在出現(xiàn)妊娠后第16天，人類胎兒組織學(xué)研究表明，在懷孕第8周(Post-conception week，pcw)時(shí)90%的紅系細(xì)胞來源于原條（Primitive streak）。胎兒中造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞突變的積累可以用于深入了解人類胚胎以及胎兒時(shí)期發(fā)育的動態(tài)過程和造血系統(tǒng)功能的起源。作者們對來自人類胚胎的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的單細(xì)胞衍生細(xì)胞群落進(jìn)行全基因組測序，并對已知來源的組織進(jìn)行深度靶向測序，從而建立起胎兒發(fā)育的系統(tǒng)發(fā)育樹。
圖1 造血干細(xì)胞與祖細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)育樹以及實(shí)驗(yàn)工作流程
作者們首先從懷孕后第8周以及第18周的兩個正常男性胎兒中采集造血器官，并使用熒光活化細(xì)胞分選的方式分離出單個造血干細(xì)胞與祖細(xì)胞（圖1）。作者們在體外擴(kuò)增了單個造血干細(xì)胞與祖細(xì)胞，并通過全基因組測序?qū)⑵錅y序深度增加至約15倍。在8周胎兒中作者們對單個造血干細(xì)胞與祖細(xì)胞來源的277個細(xì)胞克隆進(jìn)行了測序。在18周胎兒中肝臟和骨髓都會支持血液的產(chǎn)生，因此作者們對兩種來源的234個細(xì)胞克隆進(jìn)行了測序。然后對這些深度測序的克隆進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。
隨后作者們對該測序結(jié)果的敏感性以及特異性通過模擬進(jìn)行評估。在對敏感性進(jìn)行調(diào)整后，作者們對樣品中的突變負(fù)擔(dān)進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)在8周胎兒以及18周胎兒中，每個造血干細(xì)胞與祖細(xì)胞的單核苷酸變異量分別為25.5個突變以及41.9個突變。另外，作者們對構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行了不對稱性的分析，發(fā)現(xiàn)與先前的研究相一致的是，最近的共同祖先的兩個子細(xì)胞貢獻(xiàn)的不對稱性具有相當(dāng)大的差異，該結(jié)果表明此種不對稱性并非是程序性調(diào)控的。
進(jìn)一步的，作者們對發(fā)育過程突變獲得時(shí)間點(diǎn)與發(fā)育事件的時(shí)間點(diǎn)相匹配（圖2），與造血干細(xì)胞與祖細(xì)胞共享最少突變的組織可能是最先從產(chǎn)生造血細(xì)胞的祖先系中分離出來的，而更多的共享意味著后來逐漸進(jìn)行的分化過程。用此方式，作者們對所有的胚胎以及胚胎外的組織的發(fā)育計(jì)時(shí)進(jìn)行了組織，可以對發(fā)育過程中不同事件發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)。在小鼠中，滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)之間的分子分歧發(fā)生在8-16細(xì)胞階段，但在人類中這一事件的發(fā)生并不確切清楚。作者們發(fā)現(xiàn)在8周胎兒體內(nèi)此分歧事件發(fā)生在4-16細(xì)胞期，這與小鼠的發(fā)育過程類似。胚胎發(fā)育過程的另外一個重要事件是上胚層分化。作者們發(fā)現(xiàn)在上胚層分化時(shí)，至少有20種血液前系血統(tǒng)已經(jīng)存在，這與最近對人類早期發(fā)育的體外觀察結(jié)果一致。因此，該系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建對于人類胚胎發(fā)育過程中關(guān)鍵事件的計(jì)時(shí)提供了確切的證據(jù)。
圖2 發(fā)育過程中胚胎內(nèi)與胚胎外的分化時(shí)間
作者們的數(shù)據(jù)表明，與內(nèi)胚層和中胚層相比，外胚層的來源造血系統(tǒng)的祖先只有較少的貢獻(xiàn)。而且8周胎兒在循環(huán)系統(tǒng)中捕獲的原始血液來自下胚層，其體細(xì)胞突變與胚胎外、中胚層組織的體細(xì)胞突變有更高的相關(guān)性。
總的來說，該研究為未來通過使用自然發(fā)生的體細(xì)胞突變作為條形碼對人類發(fā)育過程進(jìn)行理解提供了一個可能的工作流程以及概念框架。
