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液相色譜柱的分類及常見填料分類

2020.8.25

　　一、色譜柱基本知識

　　色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3，5，7，10um等，柱效理論值可達5～16萬／米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難的分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10～30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。

　　柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，也要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。

　　1.柱的構造

　　色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70Kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2-20um(5-10um),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出，柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。

　　2.柱的發展方向

　　因強調分析速度而發展出短柱，柱長3～10cm，填料粒徑2～3um。為提高分析靈敏度，與質譜（MS）聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱（MICROBORE）。細管徑柱的優點是：①節省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現LC－MS聯用。

　　但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1～100ul/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因進樣量小，要求高靈敏度檢測器，電化學檢測幫質譜儀在這方面具有突出優點。

　　3.柱的填充

　　色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度>20um時，干法填充制備柱較為合適；顆粒<20um時，濕法填充較為理想。填充方法一般有四種：①高壓勻漿法，多有用于分析柱和小規模制備柱的填充；②徑向加壓法，WatersZL；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法，柱填充的技術性強，大多數實驗室使用己填充好的商品柱。

　　必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的結構是否合理。

　　二、液相色譜柱規格

　　色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類

　　①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm,柱長10~30cm；

　　②窄徑柱（narrowbore），內徑1~2mm，柱長10~20cm；

　　③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；

　　④半制備柱，內徑＞5mm；

　　⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；

　　⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。

　　三、色譜柱了解

　　1）平均顆粒度，顆粒度分布顆粒度(dp)越小：柱效越高(傳質好，渦流擴散小)柱壓越高(滲透性差)顆粒分布

　　顆粒分布越寬∶柱效低(滲透性差)

　　顆粒形狀球型∶柱效高、重現性好、柱床結構均勻

　　無定型：柱床結構不均勻流動相線性速度不均勻，譜帶擴展

　　2）鍵合相化學

　　1.影響化合物的分離度

　　2.不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同

　　3.可能導致色譜的分離機理不同如：C18、C8、CN

　　3）含碳量

　　1.含碳量越高，k‘值越大（固定相傳質效應增加）

　　2.高含碳量有利于不易保留的化合物的分離、水解穩定性好，重現性好、有利于極性化合物的拖尾改善

　　3.低含碳量有利于分析中性及堿性化合物、降低溶劑損耗、填料的端基封口、封口殘余硅羥基、減少不可逆吸附或拖尾、增加碳含量（0.1%-1%）

　　不同色譜柱的含碳量如下所示：

　　4）填料的端基封口

　　封口殘余硅羥基、減少不可逆吸附或拖尾、增加碳含量（0.1%-1%）

　　5）硅膠的活性

　　主要影響堿性化合物的保留行為：k'，生產硅膠時處理溫度不同，硅膠活性也不同，是選擇性差異的主要來源，硅膠的雜質含量，重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小，是色譜柱質量好壞的重要標志，填料的穩定性，硅膠填料，pH：2-8，聚合物填料，pH：2-12，pH值小于2時，鍵合相水解，液相色譜法能否將某一樣品完全分離，主要取決于色譜柱的選擇性和柱效，這在很大程度上取決于固定相的選擇是否適當。

　　6）色譜柱的規格：內徑、檢測的靈敏度、樣品的容量

　　長度、分離度，理論塔板數、速度、樣品的容量、檢測的靈敏度

　　7）柱性能評價：購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。

　　一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

　　常見色譜柱中的填料分類

　　a、反相（與離子對）方法

　　C18（十八烷基或ODS） ?---普適性好；保留性強，用途廣

　　C8（辛基） ?---與C18相似，但保留值稍小

　　C3，C4 ?---保留值小；大多用于肽類與蛋白質

　　C1【三甲基硅烷（TMS）】------保留值最小；最不穩定

　　苯基，苯乙基 ?---保留值適中；選擇性有所不同

　　CN（氰基） ?---保留值適中；正相和反相均可使用

　　NH2（氨基） ?---保留性弱；用于烴類；欠穩定

　　聚苯乙烯基b ?---在1＜PH＜13的流動相中穩定；對某些分離峰形好，柱子壽命長

　　b、正相方法