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藥物中亞硝胺雜質的 LC-MS/MS 分析方法
? 引言??
自 2018 年 6 月首次在纈沙坦中檢測到 N-亞硝基二甲胺（DMA）以來，亞硝胺相關雜質一直是制藥廠家和監管機構關注的一個問題。對此，FDA 已經確定了理論上可能存在于藥品中的 7 種亞硝胺雜質：N-二甲基亞硝胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）、N-亞硝基異丙基乙胺（NIPEA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）和 N-亞硝基甲基苯胺（NMPA）。因為藥物生產中使用的各種化學物質和工藝可能會形成其他潛在的亞硝胺雜質，因此除上述 7 種化合物之外，分析方法最好涵蓋其它化合物。
?色譜柱的選擇和分析方法的建立
我們對 100 x 2.1 mm 規格的 Raptor Biphenyl、Raptor PFPP、Raptor ARC-18、Ultra Aq-C18 和 Ultra IBD 五種色譜柱進行了對比，發現 Raptor 聯苯柱的色譜性能最好，首先是亞硝胺的峰形比其他柱上的峰形更尖銳，其次峰強度也更高。由于方法需要檢測 ppb 濃度水平的亞硝胺類化合物，更好的峰形和響應是色譜柱選擇時考慮的重要因素，因此我們選擇在 Raptor Biphenyl 聯苯柱上建立亞硝胺雜質分析方法。
Raptor Biphenyl?
100 mm x 2.1 mm, 2.7 μm (貨號：9309A12)?
100 mm x 3.0 mm, 2.7 μm (貨號：9309A1E)
在確定固定相類型后，我們在兩種規格的色譜柱上進行了方法優化，以便為不同樣品制備方法和儀器配置的實驗室提供靈活有效的分析方法。最終確定的最佳分析條件和 MRM 多反應監測參數分別如表 I 和表 II 所示。
表 I：兩支色譜柱優化的分析條件
表 2：
亞硝胺雜質分析，化合物和對應定量離子對信息
?溶劑、進樣量、色譜柱規格對色譜性能的影響
由于樣品制備方法會因藥物種類不同而有所不同，我們對比了 100% 水、水 : 甲醇（50:50）和 100% 甲醇作為稀釋劑時對色譜性能的影響。在較小規格 100 x 2.1 mm 色譜柱上，當使用較高濃度甲醇（50% 或 100%）作為樣品稀釋溶劑時，為了改善早期洗脫物（如 NDELA 和 NDILLA）的峰形，需要減小進樣體積（3 μL）來獲得可接受的峰形和響應。當使用更大規格（100 x 3.0 mm）色譜柱時，溶劑效應較弱，可以增大進樣體積，而不會對峰形產生負面影響。此外，使用較大規格色譜柱，可以使用更高比例的有機相（15% 甲醇）作為梯度洗脫的起始流動相，從而改善了使用水 : 甲醇（50:50）或 100% 甲醇作為稀釋溶劑時早期洗脫化合物的峰形。不過在較大規格色譜柱上，NDMA 和 NMBA 的檢測靈敏度略有降低。
圖 1：在 Raptor Biphenyl 色譜柱上分析亞硝胺類雜質典型色譜圖
色譜柱
Raptor Biphenyl，100x3.0mm，(貨號：9309A1E)
進樣量
5 μL
初始流動相
15% B（含0.1%甲酸的甲醇）
流速
0.5 mL/min
? 結論??
由于原料藥類型、藥物基質和制造工藝的不同，藥物中亞硝胺雜質的全面分析方法的需求正在增加。Restek 建立了允許使用不同稀釋溶劑（100% 水、50:50 水 : 甲醇、100% 甲醇）的 LC-MS/MS 方法，為 16 種亞硝胺提供了良好的色譜性能。
雖然在兩種規格（100 x 2.1 mm 和 100 x 3.0 mm）Raptor 聯苯柱上建立的兩個版本方法都可以提供良好的色譜結果，但我們仍建議各實驗室根據特定的亞硝胺待測清單和 LC-MS/MS 儀器的靈敏度來確定選擇哪個版本的方法進行分析。如需了解更多詳情，歡迎您撥打 4000-815-005 咨詢 Restek！
