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應(yīng)用速遞：亞硝胺雜質(zhì)的測定
纈沙坦是血管緊張素II受體阻滯劑（ARB）、聯(lián)苯四氮唑結(jié)構(gòu)的沙坦類化合物，用于各類輕中度高血壓的治療，尤其適用于ACE抑制劑不耐受的患者。2018年7月，藥品監(jiān)管部門首次在含有纈沙坦的產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)亞硝胺雜質(zhì)——N-二甲基亞硝胺（NDMA）。隨后在沙坦類其他藥物和雷尼替丁中都檢測到各類亞硝胺雜質(zhì)，例如N-二乙基亞硝胺（NDEA）、N-二異丙基亞硝胺（NDIPA）、N-乙基異丙基亞硝胺（NEIPA）和N-亞硝基二丁胺 (NDBA)。因此，對(duì)使用纈沙坦原料藥的藥品進(jìn)行了全球召回，導(dǎo)致纈沙坦藥品暫時(shí)短缺。
圖1?N-亞硝胺的分子結(jié)構(gòu)
根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO) 的國際癌癥研究機(jī)構(gòu) (IARC)的研究，大多數(shù)亞硝胺會(huì)對(duì)動(dòng)物和人類具有致癌和遺傳毒性。沙坦類藥物大多含有四唑環(huán)，四唑環(huán)的形成需要亞硝酸鈉；藥物的生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)用試劑和溶劑（例如普通溶劑DMF中的二甲胺）也可能會(huì)帶來污染，都有可能形成亞硝胺。歐洲藥典 (Ph. Eur.) 委員會(huì)將 API 中亞硝胺的臨時(shí)限值設(shè)定為低于 1 ppm，且于2020年底降至30 ppb。
低限值設(shè)定就需要使用靈敏度高和選擇性好的分析方法。本應(yīng)用參照美國FDA指南的方法進(jìn)行優(yōu)化，通過GC/MS/MS在EI源 MRM模式下痕量檢測纈沙坦藥品中的5種亞硝胺雜質(zhì) (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA)，并根據(jù)USP要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。
貨號(hào)
產(chǎn)品名稱
24284
SUPELCOWAX? 10 氣相毛細(xì)管柱30 m × 0.25 mm，0.50 μm
1.00668
SupraSolv? GC-MS二氯甲烷?
CRM40059
N-亞硝基二甲胺(NDMA)，5000 μg/mL溶于甲醇
PHR2407-100MG
N-亞硝基二甲胺
40334
N-亞硝基二乙胺(NDEA)，5000 μg/mL溶于甲醇
PHR2408-1G
N-亞硝基二乙胺
PHR3609-1ML
N-亞硝基異丙基乙胺(NEIPA / NIPEA)
PHR3607-1ML
N-亞硝基二異丙基胺(NDIPA)
48320-U
N-亞硝基二正丁胺，2000 μg/mL溶于二氯甲烷
PHR3608-1ML
N-亞硝基二正丁胺 (NDBA)
PHR3610-1ML
N-亞硝基甲基氨基丁酸 (NMBA)
PHR3611-1ML
N-亞硝基甲基苯胺 (NMPA)
502138
EPA 8270/附錄 IX 亞硝胺混標(biāo)
(9種組分：N-亞硝基二正丁胺 (NDBA)，N-亞硝基二乙胺，N-亞硝基二甲胺，N-亞硝基二苯胺，N-亞硝基二丙胺，N-亞硝基甲乙胺，亞硝基嗎啉，1-亞硝基哌啶，1-亞硝基吡咯烷)
40035-U
EPA 521 亞硝胺混標(biāo)
(7種組分：N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二丁胺、N-亞硝基二正丙胺、N-亞硝基甲乙胺、N-亞硝基二乙胺、1-亞硝基吡咯烷、1-亞硝基哌啶)
如果您對(duì)以上產(chǎn)品有需求
或?qū)?shí)驗(yàn)有問題，請(qǐng)掃碼提交：
GC-MS/MS 方法檢測不同的亞硝胺化合物，使用液體直接進(jìn)樣方式。與FDA方法相比，選擇了膜厚更薄（0.5μm而不是1μm）的Supelcowax?柱，符合USP通則中<621>色譜法的規(guī)定。色譜條件以及質(zhì)譜條件見表1-3。
表1 色譜條件
色譜柱
SUPELCOWAX? 10, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.5μm (24284)
檢測器
MS/MS
進(jìn)樣口溫度
250℃
柱溫箱程序
40℃保持0.5min，20℃/min至200℃, 60℃/min 至250℃保持3min
載氣及流速
氦氣，1.0mL/min
襯管
4 mm單徑錐襯管帶玻璃棉
進(jìn)樣量
2 μL
樣品稀釋劑
二氯甲烷
樣品制備
使用切片工具，取藥片的四分之一放入15mL離心管，加入5mL二氯甲烷。將樣品渦旋1分鐘，并置于離心機(jī)中以4000 rpm離心2.5min。取二氯甲烷層上清液2mL，用0.45μm PVDF膜過濾。取續(xù)濾液0.5mL到2mL樣品小瓶中并加蓋。
標(biāo)準(zhǔn)溶液
二氯甲烷作為溶劑，配制得到濃度分別2.5、5.0、10、20、40、80、100ng/mL的5種亞硝(NDMA/NDEA/NEIPA/NDIPA/NDBA)校準(zhǔn)溶液。
表2 質(zhì)譜條件
調(diào)諧
自動(dòng)調(diào)諧
離子源及采集模式
EI源，MRM
碰撞氣體
氮?dú)?@ 1.5mL/min
淬滅氣體
氦氣 @ 4.0mL/min?
溶劑延遲
7 min
離子源溫度
230°C
四極桿溫度
150°C
電離電壓
70 eV
駐留時(shí)間
50 ms
表3 MRM 離子對(duì)參數(shù)列表
峰
化合物
Transiton
保留時(shí)間
1
N-二甲基亞硝胺MRM2
74→42
6.952
N-二甲基亞硝胺MRM1
74→44
6.952
2
N-二乙基亞硝胺MRM 1
102→85
7.533
N-二乙基亞硝胺MRM2
102→56
7.528
3
N-乙基異丙基亞硝胺MRM1
116→99
7.784
N-乙基異丙基亞硝胺MRM2
71→56
7.787
4
N-二異丙基亞硝胺MRM1
130→42
7.971
N-二異丙基亞硝胺MRM2
130→88
7.976
5
N-亞硝基二丁胺MRM1
158→99
9.497
N-亞硝基二丁胺MRM2
84→56
9.494
五種亞硝胺化合物在10分鐘內(nèi)完全分離，且目標(biāo)峰與溶劑和基質(zhì)雜質(zhì)得到了很好的分離（圖 2）。由于使用了0.5μm膜厚的色譜柱，與 FDA 方法相比，分離時(shí)間更短。
圖2?40 ng/mL系統(tǒng)適用性溶液色譜圖，峰表見表3.
實(shí)驗(yàn)得出：N-二乙基亞硝胺(NDEA)和N-二異丙基亞硝胺(NDIPA)的多反應(yīng)監(jiān)測MRM Transition最低檢測限濃度為2.5ppb，如圖3所示。
圖3 NDEA（上圖）和 NDIPA（下圖）最低檢測限譜圖
經(jīng)驗(yàn)證的 FDA-OTR 方法要求 40 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)品六次重復(fù)進(jìn)樣的 RSD%≤ 5%。使用我們的方法，連續(xù)6次進(jìn)樣 40 ng/mL 的5種亞硝胺雜質(zhì)，在兩種 MRM 下的 RSD%遠(yuǎn)小于 5，如表4所示。
化合物
MRM1 RSD%
MRM2 RSD%?
N-二甲基亞硝胺
1.8
1.3
N-二乙基亞硝胺
1.1
1.1
N-乙基異丙基亞硝胺
4.2
1.5
N-二異丙基亞硝胺
0.9
2.2
N-亞硝基二丁胺
4.3
3.0
表4 40ng/mL 亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)六次進(jìn)樣的精密度
此外，線性校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)≥ 0.998。本方法中五種亞硝胺雜質(zhì)的兩個(gè) MRM都超過了這一標(biāo)準(zhǔn)（表 5）。
雜質(zhì)
MRM 1
MRM 2
N-二甲基亞硝胺
0.9994
0.9995
N-二乙基亞硝胺
0.9991
0.9995
N-乙基異丙基亞硝胺
0.9995
0.9995
N-二異丙基亞硝胺
0.9996
0.9994
N-亞硝基二丁胺
0.9983
0.9981
表5 兩種MRM定量中兩種亞硝胺的相關(guān)系數(shù) (R2)
在藥店購買的纈沙坦藥品中加入亞硝胺雜質(zhì)，濃度為10 ppb（NDBA為40 ppb），5種亞硝胺的回收率在94.5%～105.7%之間。（表6）。
雜質(zhì)
10ppb回收率
NDMA
99 %
NDEA
99 %
NEIPA
94.5 %
NDIPA
103.9 %
NDBA
105.7 %
表6 纈沙坦藥品中5種亞硝胺的加標(biāo)回收率
對(duì)于纈沙坦藥品中5種亞硝胺的檢測，F(xiàn)DA 方法的定量限 (LOQ) 范圍是 8 – 40 ppb，本實(shí)驗(yàn)方法的 LOQ見表 7。LOQ 是根據(jù)每種化合物校準(zhǔn)曲線信噪比 (S/N) 為 10 濃度計(jì)算得出的，并且通過纈沙坦片劑的標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。檢出限LOD是信噪比 (S/N) 為 3 的濃度計(jì)算得到 。
雜質(zhì)
FDA方法 LOQ? [ppb]
本實(shí)驗(yàn)方法LOQ [ppb]
NDMA
133
NDEA
85
NEIPA
83
NDIPA
85
NDBA
4032
表7 FDA和實(shí)驗(yàn)方法LOQ結(jié)果
綜上，參考FDA 建議方法，使用 SUPELCOWAX? 色譜柱通過 GC-MS/MS在 MRM 模式下可以輕松實(shí)現(xiàn)亞硝胺雜質(zhì)的測定。所有亞硝胺化合物之間以及與溶劑和基質(zhì)峰的分離良好，滿足所有系統(tǒng)適用性要求。該方法已成功應(yīng)用于纈沙坦藥物中亞硝胺類雜質(zhì)的分析。
