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技術應用|紅曲產品中桔青霉素的檢測
近期，日本有多人在服用小林制藥公司生產的含紅曲成分保健品后因腎臟疾病住院甚至死亡。此事件把日本百年藥企小林制藥，推上了風口浪尖。同時，也讓紅曲再次進入了大眾的視野。
? ? ??關于紅曲
? ? ? ? 紅曲也叫紅曲紅、紅曲霉、紅曲米等，其作為一種天然發酵產物，其成分相對復雜，包括多種具有生物活性的物質。其用糯米蒸制后接種紅曲菌種，發酵繁殖的，產品是發酵后的暗紅色糯米，經粉碎后成為紅曲粉。它在食品工業中應用十分廣泛，南方做燒肉或豆腐乳多使用。
同時，紅曲還具有降壓降脂、活血化瘀、健脾消食的功效。在保健品和藥品中也有廣泛應用。
1、降壓降脂：紅曲可以降低血液黏稠度，提高血管舒張能力，恢復血管的彈性，降低血管的外周阻力，促進血壓平穩下降。而且紅曲中還含有他汀類物質，能降脂。所以紅曲具有調節血壓、降低血脂的功效。
2、活血化瘀：紅曲可以活血化瘀，主治產后惡露不盡、瘀滯腹痛、跌打損傷。
3、健脾消食：紅曲可以健脾消食，主治飲食停滯、胸膈滿悶、消化不良或赤白下痢。
紅曲的相關標準：
根據國家標準GB?2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》及其增補公告，紅曲米及紅曲紅作為著色劑可用于腐乳、碳酸飲料 、果凍、糕點、配制酒等多種食品中，其中風味發酵乳中的最大使用量不得超過0.8 g/kg，糕點中的使用量不得超過0.9 g/kg，焙烤食品餡料及表面用掛漿不得超過1.0 g/kg，其他允許使用的食品則可根據生產需要適量使用。
另外鑒于紅曲中桔青霉素的危害，國家也設定了限量標準，GB 1886.181-2016《食品安全國家標準 食品添加劑 紅曲紅》中規定紅曲紅中桔青霉素的限量為0.04 mg/kg。
? ? ??桔青霉素親和柱簡介
? ? ? ?參考《GB/T 5009.222-2016 食品安全國家標準食品中桔青霉素的測定》，樣品經提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有桔青霉素特殊抗體的免疫親和柱。此時，桔青霉素被親和柱中的抗體特異性吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將桔青霉素從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或液質方法進行定量檢測。
桔青霉素親和柱規格：
柱容量：100ng，
包裝：25支/盒，
保存：2-8℃
保質期：18個月
使用對象
本方法適用于紅曲制品、糧食、食品、飼料、調味品、藥材和酒類等樣品中桔青霉素的測定
實驗溶液制備
1)????? 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均勻。
2)?????pH7.0 PBS溶液：Clover pH7.0 PBS鹽包（貨號：C3001）：將鹽包用1000ml純水直接溶解，備用。保質期18個月。
3)????? 0.1%吐溫 20-PBS 溶液:準確移取 1mL 吐溫-20 以pH 7.0 PBS緩沖溶液定容至 1000mL。或10倍濃縮0.1%吐溫PBS緩沖液（貨號：G1112-C）直接稀釋10倍使用。
4)????? 0. 1% 磷酸溶液:準確移取 1mL 磷酸加水定容至 1000mL。
5)????? 洗脫液 :甲醇-0. 1% 磷酸溶液( 70+30 ) 取70mL甲醇加30mL0. 1% 磷酸溶液( 70+30 )，混合均勻。
樣品前處理：
1、紅曲及其制品：
稱取5g磨細的樣品，置于250mL錐形瓶中，或勻質杯中。加入100mL甲醇/水（7+3）溶液。以均質器高速勻質提取2min。將提取物到入槽紋濾紙或普通濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取1mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用39 mL pH 7.0 PBS溶液：稀釋，混勻。將上步稀釋液通過玻璃微纖維過濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準備上柱凈化。
2、大米，玉米，辣椒等
稱取10g磨細的樣品，置于150mL錐形瓶中，或勻質杯中。加入50mL甲醇/水（7+3）溶液。以均質器高速勻質提取2min。將提取物倒入槽紋濾紙或普通濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取1mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用49 mL pH 7.0 PBS溶液：稀釋，混勻。將上步稀釋液通過玻璃微纖維過濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準備上柱凈化。
親和柱凈化程序：
? ? ?將上步10 mL濾液，以1滴/秒的流速全部通過免疫親和柱，直至空氣進入到親和柱中。用10 mL pH 7.0 PBS溶液或0.1%吐溫 20-PBS溶液以1-2滴/秒的流速淋洗親和柱。用1mL 洗脫液（甲醇-0. 1% 磷酸溶液70+30）以1 滴/秒的流速淋洗親和柱，將所有樣品洗脫液收集于玻璃測試管中，混勻，注入HPLC檢測。
液相色譜條件：
色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）
流速：0.8mL/min
檢測器：熒光檢測器，激發波長350nm,發射波長500nm;
進樣體積：20~100uL
流動相1：0.1%磷酸:乙腈=35:65(V/V)
流動相2：流動相 A 液:乙腈，流動相 B 液:0. 1% 磷酸。
流動相及梯度洗脫條件見表
時間 /min
乙腈 ?/? %
0. 1% 磷酸 ?/? %
04060140607901099010104060154060
實驗圖譜及數據：
高效液相色譜儀桔青霉素標準品（50ppb)譜圖如下：
紅曲粉樣品加標(2000ppb)譜圖如下：
添加回收實驗數據如下：
紅曲粉樣品1
紅曲粉樣品2
本底（ppb）
0.00
845
加標2000ppb
2026
2820
回收率
101%
99%
