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熱點應(yīng)用丨ATR-FTIR技術(shù)在生物液體--人類血清白蛋白研究中的應(yīng)用
衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)是分析生物流體的一種理想技術(shù)。紅外光譜記錄分子鍵振動，可以獲得生物樣品的紅外指紋圖譜。醫(yī)療保健研究人員和臨床醫(yī)生關(guān)注“液體活檢”（一種微創(chuàng)的樣本收集方法）。許多生物液體，如尿液、唾液和血液，可以使用ATR-FTIR進行研究。利用生物液體樣品之間的光譜差異，可以區(qū)分健康患者和患病患者。
血液是醫(yī)學(xué)診斷中應(yīng)用最廣泛的生物液體，它由血漿、紅細胞、白細胞和血小板組成。對于光譜分析，通常使用血漿或血清，因為這兩種液體可以冷凍保存。血液的冷凍過程會導(dǎo)致細胞破壞，血紅蛋白對光譜信號影響很大。血漿是在抗凝管中離心分離的水溶液，而血清是通過血液凝固分離血細胞和血小板得到的，如圖1。血清更常用，因為血清的制備方法可以有效地去除紅細胞。
圖1 血漿和血清
ATR-FTIR技術(shù)在中紅外區(qū)域（4000cm-1~400cm-1）檢測生物樣品（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和氨基酸）中功能基團的基本振動，僅需要幾微升的小樣本量，即可提供快速的結(jié)果；同時也是一種節(jié)約成本、易于使用的診斷方法。ATR-FTIR技術(shù)進行血清分析已用于許多疾病研究，如癌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、腦部疾病和病毒感染1~6。
水對生物液體測試的影響
ATR-FTIR技術(shù)在進行生物液體樣品分析時，水會對紅外光譜的產(chǎn)生影響，圖2。水的極性很強，會產(chǎn)生強烈的紅外響應(yīng)；當使用ATR-FTIR分析生物流體樣品時，水的紅外光譜掩蓋了樣品中的生物信息。通常，在檢測生物液體時，測試者必須等待樣品干燥；這很耗時，并延長了總測試時間。更快的方法是使用加熱ATR附件。通過加熱樣品，水分蒸發(fā)得更快，總測試時間顯著減少。本文使用加熱ATR附件的IR5紅外光譜儀，去除水分并快速測量血清樣本的光譜。
圖2 紅外光譜中的水峰
實驗設(shè)備及方法
配有加熱ATR附件的愛丁堡IR5傅里葉變換紅外光譜儀，測量人類血清白蛋白樣本。ATR的反射晶體選擇金剛石材質(zhì)（高折射率和耐用性）。由于其優(yōu)異的導(dǎo)熱性，金剛石ATR附件適合于加熱實驗。
圖3 IR5傅里葉變換紅外光譜儀（a）和ATR加熱附件（b）
為了驗證加熱ATR附件對干燥時間的影響，將3μL樣品移液到ATR上，不加熱ATR采集光譜。ATR預(yù)熱并保持在50℃恒定，重復(fù)此過程。紅外光譜的分辨率設(shè)置為4cm-1，掃描10次，每個光譜的總測試時間為35秒。
結(jié)果與討論
人血清白蛋白在室溫下干燥2分鐘(藍色)和ATR加熱(紅色)的紅外光譜，如圖4所示。在室溫ATR測量中，光譜以水的吸收峰為主，生物光譜信息被覆蓋。使用加熱ATR可獲得無水干擾的完整生物光譜。如果將藍色光譜樣品在室溫下干燥，需要超過15分鐘的干燥時間，生物光譜才能充分顯示，這大大降低了測量通量。
圖4 人類血清白蛋白的ATR-FTIR光譜圖
（藍色：室溫下干燥2分鐘；紅色：加熱至50℃干燥）
ATR-FTIR提供了生物液體樣品中生物成分的重要信息，圖5給出了血清樣本光譜的波段分布。紅外生物光譜分布在兩個區(qū)域：從2600cm-1到3800cm-1的高波數(shù)區(qū)域，以及由雙鍵拉伸和指紋區(qū)組成的2000cm-1到500cm-1的低波數(shù)區(qū)域。低波數(shù)區(qū)域提供具鑒別性的數(shù)據(jù)，也是最常用于診斷的區(qū)域7。
圖5 人類血清白蛋白的紅外光譜波段分布
結(jié)論
本文通過血清樣本的生物指紋圖譜測試，表明IR5對生物液體分析的高靈敏度。IR5傅里葉變換紅外光譜儀配備加熱ATR附件，克服了樣品含水的問題。使用加熱ATR附件，在不降低光譜質(zhì)量的情況下，使光譜采集所需的干燥時間大大縮短。
參考文獻
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