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光譜技術應用 | 吸光度
從紫外到近紅外再到更長的波長，吸光度測量提供了有關物質在所有狀態下的化學成分的有價值的信息。
吸光度測量優勢：
無損測量-除非你的樣品是光敏的，否則測量可以在不改變樣品的情況下重復進行。
定量結果-用吸光度測定溶液濃度。
準確性和重復性-使用適當的工具和方法，吸光度可以被量化，具有很高的測量的精度。
一、吸光度與朗伯-比爾定律
當一束光通過一個吸光物質（通常為溶液）時，溶質吸收了光能，光的強度減弱；吸光度就是用來衡量光被吸收程度的一個物理量，其影響因素有溶劑、濃度、溫度。分析物濃度越高，穿過材料的光子被吸收的機會就越大。吸光度的測量簡便高效，因此被廣泛應用于液體和氣體的光譜測量技術, 集成至工業測試系統，還可以用于科研分析。
朗伯-比爾定律是光吸收的基本定律，是描述物質對某一波長光吸收的強弱與吸光物質的濃度及其液層厚度間的關系。朗伯比爾定律是吸光光度法、比色分析法和光電比色法的定量基礎，適用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質，包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子。
光被吸收的量正比于光程中產生光吸收的分子數目。吸光度直接取決于吸收分子的濃度和光穿過材料的光程，光程越長，檢測限越低。高濃度樣品需要較短的光程。光被透明介質吸收的比例與入射光的強度無關；在光程上每等厚層介質吸收相同比例值的光。
朗伯-比爾定律計算公式：
其中，A(λ)為某波長下的吸光度值，ε(λ)為吸收系數，c為溶液的濃度（單位mol/L），l為溶液厚度（單位cm）。
二、如何計算吸光度？
當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質時，其吸光度A與吸光物質的濃度c及吸收層厚度l成正比，而與透光度T成反比。
透過率T是透射光強度 (It) 與入射光強度 (I0) 的比值，并且會隨著光程長度和濃度的增加而降低。通過透射率T來計算吸光度：
吸光度單位?(AU) 是光譜儀測量濃縮樣品能力的量度；
Ocean的光譜儀的AU范圍為0~1.75 AU，適用于大多數應用；
HDX 光譜儀的 AU 范圍為 0 – 3.5；
雜散光是限制光譜儀 AU 范圍的關鍵因素?
朗伯-比爾定律是一個線性方程。使用已知濃度的標準溶液測量吸光度值，吸光度與濃度之間可以建立一條線性關系的標準曲線；通過測量未知樣品的吸光度值，從線性關系曲線中可以讀取該樣品的濃度值。
值得注意的是，隨著濃度的增加，由于檢測器的非線性，濃度值數據可能也會變得非線性。因此，在每個系統中需要對數據進行多項式校正。
三、吸光度測量的應用案例
應用案例1：測量重鉻酸鉀吸光度標準品
測量吸光度實驗包括海洋光學HR2-UV-VIS光譜儀、帶衰減器的DH-2000氘燈光源、兩根400 μm光纖，石英比色皿、Square One比色皿支架和OceanView軟件。
圖1.重鉻酸鉀標準品的紫外吸光度（濃度范圍20.27-100.95 mg/L）
圖1為使用Ocean HR2測得的紫外吸收譜，可看出Ocean HR2出色的低雜散光性能，特別是當繪制與濃度關系時，其吸光度線性度為0.9997（圖2）。
圖2.高吸光度線性度是Ocean HR2光譜儀的一個特點
藍色線為重鉻酸鉀標準品的測量結果，基于該標準曲線，可預測該波長范圍內1.5AU以下幾乎任何樣品的濃度。
應用案例2：牛血清白蛋白BSA
牛血清蛋白（BSA）常用作生化應用中的蛋白質濃度標準品。使用與重鉻酸鉀實驗相同的Ocean HR2光譜儀配置，在蒸餾水中測量了質量同為503mg的30種不同濃度的BSA。為確保獲得最佳測量結果，建議在實驗中應注意以下：
測量前，將光譜儀和光源預熱30分鐘。預熱有助于光源達到熱平衡狀態，避免由于光源輸出的微小變化而導致的測量偏差；
采樣時避免取下石英比色皿，因為這樣做可能會引入錯誤。正確的做法是，在比色皿中進行溶液稀釋，使用一次性移液管吸取每個樣品的一部分，然后在去離子水中混合，并對每個樣品重復該過程；
盡量避免測量中移動光纖。
圖3.BSA樣品在 279 nm 處有強烈的吸收峰
使用BSA測量的吸光度線性度結果甚至比重鉻酸鉀更好。取279 nm處的吸收峰（圖3），吸光度直至2.5AU，也能保證吸光度線性度0.999（圖4）。這種性能使Ocean HR2成為定量其他類型的蛋白質濃度及生物應用，如分析血液成分和對藥物配方進行質量保證的絕佳選擇。
圖4. 近30個BSA樣品上測得的吸光度線性度高達0.999
內容來源：愛蛙科技編輯整理
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