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創(chuàng)新LNP驅(qū)動(dòng)核酸藥物蓬勃發(fā)展

艾杰爾飛諾美
2023.9.08

隨著科學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，近年來(lái)多種新型藥物遞送技術(shù)的突破為眾多創(chuàng)新藥物的臨床轉(zhuǎn)化提供了強(qiáng)勁的動(dòng)力。目前常用的遞送載體主要包括脂質(zhì)納米顆粒（LNP）、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）、類(lèi)病毒顆粒等，其中LNP作為一種具有多方位的優(yōu)勢(shì)的遞送載體，已經(jīng)在mRNA、寡核苷酸藥物、CRISPR基因編輯等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。相較于其他遞送系統(tǒng)，LNP組織穿透性強(qiáng)，細(xì)胞毒性和免疫原性低，核酸包封率高且能夠有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能夠更好地用于藥物遞送。這些優(yōu)勢(shì)使LNP成為出色的核酸藥物遞送系統(tǒng)，已經(jīng)有多款采用LNP遞送系統(tǒng)的核酸藥物取得了優(yōu)異的商業(yè)化成績(jī)。

LNP的典型結(jié)構(gòu)特征

LNP遞送系統(tǒng)的配方通常由可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如KC2、MC3和C12-200)、兩性離子脂質(zhì)(如DOPE)、膽固醇和脂質(zhì)錨定的聚乙二醇酯的精確摩爾比組成。其配方和應(yīng)用存在工藝參數(shù)構(gòu)筑的壁壘，即使是mRNA巨頭Moderna、BioNTech所采用的LNP 遞送系統(tǒng)都面臨著相關(guān)糾紛。目前 LNP 遞送系統(tǒng)的參數(shù)壁壘主要在Arbutus手中，其范圍覆蓋核酸、陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)、綴合脂質(zhì)以及各成份的比例，給后來(lái)者建起了一道難以逾越的鴻溝。因此，突破LNP的技術(shù)高墻，研發(fā)出高效、安全的遞送系統(tǒng)，成為了mRNA企業(yè)發(fā)展的重中之重。

常用的LNP遞送技術(shù)開(kāi)發(fā)策略包括對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)行改造，對(duì)PEG末端的修飾，替換膽固醇等方式。根據(jù)結(jié)構(gòu)特性，用于RNA遞送的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)可分為不飽和（含不飽和鍵）、多尾（含兩條以上尾）、聚合物（含聚合物或樹(shù)狀大分子）、可生物降解（含可生物降解鍵）和支化型（含分支尾）脂質(zhì)。其可修飾的位點(diǎn)包括：脂溶性烷烴鏈或不飽和烴鏈的長(zhǎng)度和不飽和度的考察，連接節(jié)點(diǎn)化學(xué)鍵種類(lèi)的考察，含叔胺個(gè)數(shù)的考察。其中連接節(jié)點(diǎn)化學(xué)鍵的選擇是賦予LNP功能性最為關(guān)鍵的點(diǎn)，解決可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)的細(xì)胞毒性也是關(guān)鍵點(diǎn)之一。對(duì)PEG末端的修飾或通過(guò)化學(xué)修飾手段對(duì)LNP進(jìn)行改造，以增強(qiáng)其mRNA表達(dá)能力或者賦予其特殊逃逸能力也有著巨大的應(yīng)用前景。

已用于mRNA疫苗或藥物遞送的可電離脂質(zhì)（NATURE COMMUNICATIONS | (2021) 12:7233）

對(duì)LNP的創(chuàng)新和改造，需要采用合適的方法及工具對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析，以確保結(jié)果的正確性和有效性。對(duì)于LNP的結(jié)構(gòu)特征，丹納赫生命科學(xué)旗下SCIEX的ZenoTOF??7600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)的 EAD 電子活化裂解技術(shù)，可單針進(jìn)樣對(duì) LNP 中可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深度鑒定，特別是對(duì)氧化位點(diǎn)進(jìn)行精確解析。如對(duì)DLin-MC3-DMA的分析中，ZenoTOF??7600可裂解其烷基鏈的每個(gè)C-C鍵，從而確定其雙鍵的位置。

SCIEX的ZenoTOF??7600?

對(duì)DLin-MC3-DMA中典型結(jié)構(gòu)的分析

在對(duì)其雜質(zhì)的分析中，EAD產(chǎn)生的離子碎片信息可用于識(shí)別和區(qū)分兩種含氧異構(gòu)體。在m/z 558.5、574.5和587.5處觀察到的特定離子顯示雜質(zhì)1的烷基鏈的C6/C31處存在氧摻入（藍(lán)色圓圈，頂部）。m/z 61.05處的特定碎片離子表明氧摻入雜質(zhì)2的叔胺（N-氧化物）中（綠色圓圈，底部）。

SCIEX?的ZenoTOF??7600?

對(duì)DLin-MC3-DMA中雜質(zhì)的分析圖譜

另外，LNP結(jié)構(gòu)的優(yōu)化會(huì)導(dǎo)致LNP的電荷發(fā)生變化，從而影響mRNA-LNP的生物分布和表達(dá)。SCIEX的毛細(xì)管電泳PA 800 Plus制藥分析系統(tǒng)可采用等電聚焦電泳cIEF的形式對(duì)LNP甚至是包裹好mRNA的LNP等電點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)行時(shí)采用30cm的毛細(xì)管進(jìn)行聚焦，三個(gè)pI marker進(jìn)行pI值的計(jì)算，可使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

SCIEX的PA 800 Plus

對(duì)mRNA-LNP進(jìn)行檢測(cè)的電泳圖

對(duì)于LNP及相關(guān)成份的生物學(xué)分布，丹納赫生命科學(xué)旗下艾杰爾-飛諾美的一系列色譜柱可以幫助進(jìn)行液相色譜柱的生物分析方法開(kāi)發(fā)。在對(duì)血清中某陽(yáng)離子氨基脂質(zhì)的分析時(shí)，采用艾杰爾-飛諾美Kinetex EVO C18核殼色譜柱，其獨(dú)特的乙基交聯(lián)有機(jī)硅膠殼層，能夠增強(qiáng)表面惰性，提升對(duì)復(fù)雜流動(dòng)相條件的耐受性和穩(wěn)定性。

血清中某陽(yáng)離子氨基脂質(zhì)的液相分析

及Kinetex EVO C18色譜柱的特點(diǎn)

色譜柱：Kinetex EVO C18 （2.1 × 100 mm, 2.6 μm, 100 ?）；

流動(dòng)相A相：0.1%甲酸水溶液；

流動(dòng)相B相：含10mM乙酸銨和0.1%甲酸的甲醇/異丙醇（1:1）；

流 ?速：0.6 mL/min；

柱 ?溫：40 ℃；

進(jìn)樣量：5 μL；

離子源類(lèi)型：電噴霧離子源（ESI+）；

噴霧針電壓：正源5500 V；

離子源溫度：500 ℃

在對(duì)含尾部支鏈脂質(zhì)的液質(zhì)分析時(shí)采用帶有保護(hù)性丁基側(cè)鏈的Kinetex XB-C18核殼色譜柱，其對(duì)于空間結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的脂質(zhì)成份，能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的氫鍵與疏水選擇性，提供空間位阻作用，減少次級(jí)吸附，改善堿性化合物的峰形，提高酸性化合物的保留。

含尾部支鏈脂質(zhì)總離子電流圖（左）

和主要成份色譜圖（右）

Kinetex XB-C18色譜柱的特點(diǎn)

色譜柱：Kinetex XB-C18；2.6 μm，4.6×100 mm

流動(dòng)相：A相：5mM甲酸銨甲醇-水溶液（甲醇：水=3:1），B相：乙醇；

柱 ?溫：30℃；

進(jìn)樣量：3 μL

檢測(cè)器：SCIEX 4000+

離子源：電噴霧離子源

掃描方式：負(fù)離子掃描

電噴霧電壓：-4500 V

離子源溫度：500℃

采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)

遞送技術(shù)在藥物治療領(lǐng)域逐漸開(kāi)始發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，其中LNP作為一種相對(duì)較為成熟的遞送系統(tǒng)，已經(jīng)在mRNA、基因治療等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出強(qiáng)大的商業(yè)潛力。然而，LNP開(kāi)發(fā)和制造的壁壘相對(duì)較高，開(kāi)發(fā)新的可電離脂質(zhì)并大規(guī)模生產(chǎn)耗時(shí)又長(zhǎng)，因此繞過(guò)壁壘開(kāi)發(fā)高效、安全的遞送系統(tǒng)仍然是我國(guó)企業(yè)布局的重要方向。目前，國(guó)內(nèi)已有多家企業(yè)積極投入與LNP相關(guān)的新技術(shù)研究及保護(hù)建設(shè)，并已經(jīng)研發(fā)出了極具創(chuàng)新性的LNP遞送系統(tǒng)。另外，隨著藥物遞送系統(tǒng)相關(guān)理論、設(shè)計(jì)理念、研究方法和技術(shù)水平的不斷提高，多學(xué)科領(lǐng)域合作的日益加強(qiáng)，LNP遞送系統(tǒng)將逐步發(fā)展完善并步入更高層次領(lǐng)域。

參考資料：

1.Huang Q, Zeng J, Yan J. COVID-19 mRNA vaccines. J Genet Ge

2.國(guó)金證券研報(bào)、中泰研究院研

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