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中藥篩選抗氧化天然產物取得新進展
中醫藥是中華民族數千年來與疾病斗爭的智慧結晶，具有豐富的臨床實踐經驗和完整的理論體系，在中醫藥理論指導下組方或以中藥為資源發現和研發創新藥物，一直是中國新藥創制的重要途徑之一。多項研究顯示源于中藥與天然產物的活性物質具有抗氧化活性，但是如何篩選和高效評價哪些成分能通過抗氧化應激調控細胞命運仍缺乏有力工具。
自 20 世紀中期自由基衰老理論被提出至今，氧自由基在卒中、心肌缺血、神經退行性等衰老及相關疾病中的作用逐漸得到認識[1-4]。在各類活性氧中，超氧陰離子屬源頭物質，在氧化還原信號通路及氧化應激病理損傷事件中發揮重要作用，但超氧陰離子難以被標記追蹤，如何以高時空分辨率原位追蹤活細胞超氧化物動力學，對于發現能高效調控細胞內活性氧穩態平衡的活性物質具有重要意義[7-8]。
2023 年 3 月 14 日，浙江大學王毅教授及李新副教授共同通訊在 Nature Communications 發表題為 “1,2,4,5-Tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity” 的論文，開發了一類以 1,2,4,5-四嗪基為超氧陰離子特異性識別官能團的熒光探針，實現了超氧陰離子的高度選擇性檢測，并以該探針為基礎，從天然產物庫中運用高內涵篩選技術篩選到了具有良好的抑制超氧陰離子生成作用的中藥活性成分。
作者首先設計并通過實驗驗證了適用于從 445 nm~ 600 nm （藍色~紅色熒光）發射的系列探針（圖 1），確認了該類探針在分子層面、細胞層面對超氧陰離子的高度選擇性，及其相較于傳統檢測探針如 DCFHDA（非選擇性活性氧探針）、DHE （超氧化物特異性探針）在選擇性、信噪比方面的優勢（圖 2）。
圖 1，Tz 系列探針結構
圖 2，四嗪類熒光探針與已知標記物 DCFHDA、DHE 在細胞水平對超氧選擇性的對比。
Tiron：超氧陰離子清除劑；TEMPO：超氧化物歧化酶 （SOD）類似物，可有效中和活性氧。
接下來研究團隊建立了高內涵抗氧化活性成分篩選流程，通過 150 μM 常用氧化劑——過氧叔丁醇（tBHP）誘導小鼠心肌細胞 H9C2 累積超氧化物，加入天然產物庫中的 223 種化合物處理細胞之后，利用 F-Tz4（1μM）探針標記超氧化物含量，最后使用高內涵成像系統采集細胞圖像并計算 F-Tz4 熒光強度和細胞數量，以此計算化合物對超氧化物累積的抑制率，篩選抗氧化活性成分（高內涵篩選流程見圖 3）。
圖 3，高內涵篩選流程
通過篩選作者從天然產物庫中發現了 7,8-二羥基黃酮、青藤堿等中藥活性成分具有良好的抑制超氧陰離子生成作用，特別是首次發現 5a-膽甾烷-3-酮能有效抑制過氧叔丁醇刺激導致的心肌細胞超氧陰離子積聚（圖 4）。
圖 4，新型熒光探針 F-Tz4 應用于體內外成像和高內涵藥物篩選
最后作者利用小鼠模型，成功實現了氧化損傷心肌細胞和缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中超氧陰離子的跨尺度成像，并發現 5a-膽甾烷-3-酮能顯著降低小鼠心肌缺血再灌注損傷。初步的機制研究表明，該化合物通過激活胞內 NRF2/HO-1 抗氧化通路發揮抗氧化作用（圖 5）。
圖 5，5a-膽甾烷-3-酮具有體內外心肌保護作用
該研究首次設計了 1,2,4,5-四嗪基超氧陰離子高度特異性熒光探針，利用 Molecular Devices 高內涵成像系統建立了抗氧化活性成分篩選模型，以此發現了新的活性化合物并初步探索了其體內外活性和機制，相關工作也為抗氧化先導化合物發現及中藥藥效物質研究提供了新的思路與工具。
隨著《中華人民共和國中醫藥法》的頒布與實施，中醫藥將迎來前所未有的發展機遇。但是中藥常常是活性組分或組分群通過多個靶點發揮作用，且這些組分之間具有配伍效應。這些特點對于闡述其作用機制提出了更高的要求，而高內涵篩選則能夠快速高效地獲得被篩藥物對細胞所產生的實時快速和多維立體的生物效應信息，為系統研究中醫藥提供了一種新工具。既可以針對中藥多組分、多成分的特點，進行高通量篩選，大幅度提高工作效率，也可利用微量、高效的特點，設計與分析配伍效應。應用高內涵成像分析系統開展中藥作用機制和中藥復方研究有廣闊的發展前景，對推動中藥現代化有重要意義。
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原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-37121-8
參考文獻
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