質(zhì)粒純化的層析純化瓶頸，如何破局？

伯樂生命科學(xué)

2023.3.09

隨著細(xì)胞治理以及核酸疫苗的快速發(fā)展，除了最終成品的支持工藝，作為過程使用的多種原理的生產(chǎn)工藝也越來越受到重視，這些中間工藝的優(yōu)化對提高產(chǎn)品質(zhì)量和降低生產(chǎn)成本方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

質(zhì)粒作為細(xì)胞治療和 mRNA 的前期原料一直其純化工藝就受到各種限制，其中可以進(jìn)行大規(guī)模下游生產(chǎn)的層析法更由于層析填料的特點(diǎn)限制了其純化效率。一般情況下，很多層析填料都是為蛋白質(zhì)純化設(shè)計(jì)的，內(nèi)部孔洞更小，不利于質(zhì)粒的內(nèi)部吸附；進(jìn)而導(dǎo)致有效的吸附表面非常少，降低了吸附效率。一般情況下，其吸附質(zhì)粒的效果低于吸附蛋白的50倍以上。(Ferreria,?et?al, 2000）

為了提高純化的質(zhì)量和效率，很多人開始選擇大孔徑的復(fù)合模式填料。Aberin?和 Franklin 等人在 2002 年成功的報(bào)道了用 CHT?II 型（陶瓷羥基磷灰石）進(jìn)行一步法的質(zhì)粒純化，獲得了藥品級純度的產(chǎn)品。

Bio-Rad 研發(fā)部門采用 CHT II 20um 裝填到1ml 的層析柱中，然后對質(zhì)粒樣品 pS3（10Kb）pS5（9,48Kb）pUC19（2.6Kb）進(jìn)行了純化。

線性流速 311cm/hr

結(jié)合 Buffer：Na3PO4 10mM pH 7.0, EDTA 0.1mM

洗脫 Buffer：Na3PO4 0.4M pH 7.0, EDTA 0.1mM

動態(tài)結(jié)合載量和產(chǎn)量和質(zhì)粒的類型有關(guān)。

對于不同的結(jié)合 Buffer，也會導(dǎo)致 CHTII 對質(zhì)粒的吸附。使用 20mM pH7.5 的磷酸鈉和 pH7.5 的硼酸溶液進(jìn)行測試，會發(fā)現(xiàn)硼酸緩沖液導(dǎo)致了 pUC19 的結(jié)合升高，但是 PS5 的下降。暗示較小的質(zhì)粒采用硼酸緩沖體系可能會對結(jié)合以及產(chǎn)量有幫助。

在結(jié)合液中添加添加劑可以幫助提高結(jié)合效率，一般添加 NaCl 或 Ca2Cl。0.6M 的 NaCl 可以明顯的提高產(chǎn)量，Ca2Cl 在 5.5mM 的時(shí)候效率最高，但是過多的添加會形成渾濁的沉淀。

CHT 陶瓷羥基磷灰石具有很高的剛性，可以輕松的進(jìn)行規(guī)模放大。在質(zhì)粒純化工藝的優(yōu)化過程中，除了填料的選擇也和質(zhì)粒的二級結(jié)構(gòu)，裂解液，離子特性有關(guān)，因此具體的方案仍然需要在CHT上進(jìn)行優(yōu)化。但是優(yōu)化的工藝路線是明確的，最好的是在磷酸鹽的溶液中進(jìn)行，調(diào)整pH，NaCl或者Ca2Cl的濃度，實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)和純凈質(zhì)粒的分離。

此外，CHT一步法的純化得到的質(zhì)粒產(chǎn)品可能會具有更多的優(yōu)勢，因?yàn)镃HT可以對多種核酸以及內(nèi)毒素都有一定吸附能力，因?yàn)樵趦?yōu)化工藝的分離后，樣品中其宿主殘留的核酸或者內(nèi)毒素也能被消除。

引用文獻(xiàn)

·?Aberin?CS?and?Franklin?SG（2002），Plasmid?Purification?using?CHT?Ceramic?Hydroxyapatite Support. Bio-Rad Bulletin 2731

·?Ferreira GN et al.(2000).Downstream Processing of Plasmid DNA for gene?Therapy?and?DNA?Vaccine application.?Trends Biotechnology 18,380-388

* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定區(qū)域的商標(biāo)。

* 本產(chǎn)品僅用于科研用途，不用于臨床診斷。

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