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一次讀懂qPCR結果中的質控（Quality Control）
作為技術支持，在日常的工作中經常會遇到客戶咨詢：
我的qPCR結果中為什么有一個黃色的三角（圖1），里面還有1,2,3,4這些數字，它們代表的含義是什么？
有這些提示的存在，會影響我的實驗結果嗎？我的結果還可信嗎？
那么我又應該如何避免這些黃色三角提示呢？
今天，小編就和大家一起來聊一聊如何查看qPCR結果分析中的質控（Quality control ；QC），不同的質控提示代表的含義以及在平時的實驗中如何減少/避免這些提示（本文主要以我們公司Applied Biosystems?品牌的常用機型 7500系列、QuantStudio系列以及StepOne / StepOne Plus系列為主）。
我們都知道，qPCR作為一種簡單高效的定量方法，可以用于樣本濃度定量、拷貝數定量、基因表達定量、熔解曲線、SNP分型分析等。正如我們日常購買的商品出廠前都要經過質檢，我們ABI品牌的qPCR儀器自帶的分析軟件也對每次的實驗結果有著一系列的質控參數，這些質控參數能夠幫助我們更好的去判斷和分析在加樣、試劑、耗材、擴增反應以及儀器狀態等方面是否存在異常。
接下來給各位老師介紹如何查看本次實驗中存在哪些質控信息，以StepOne Plus儀器的一次結果為例，在結果分析界面，我們可以看到如圖1所示，96個孔中都標記了黃色三角，里面標記的數字有的是“1”，有的是“2”，隨后我們在Analysis?界面上
圖1：在qPCR的結果分析界面，我們通常能看見樣本孔中有黃色的三角提示，上面分別寫有1、2、3的字樣。
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圖2：StepOne Plus儀器上何查看本次實驗質控提示的操作步驟（7500、QuantStudio 6/7 系列儀器查看方式類似）。
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圖3：QuantStudio 1/3/5分析軟件上查看本次實驗質控提示的操作步驟
接下來和大家聊一聊不同報錯提醒的含義、存在的原因以及如何減少/避免。初步統計，我們一共有17種不同類型的質控提示，下面分別進行介紹：
01
AMPNC: Amplification in negative control，通過字面意思我們可以清楚的知道質控提示是因為陰性對照存在擴增（圖4，通常Ct< 35.0）。針對這種情況，我們需要首先確認該孔是不是真的是陰性對照孔，有沒有存在標記錯誤或者加樣錯誤等因素，其次我們要去查看擴增的熒光曲線是否正常，可以通過多組分圖（Multicomponent plot）中的擴增結果確定目的基因是否有擴增（圖5）。如果確認存在擴增，那么就說明我們的擴增體系中存在污染，污染的可能性包括但不限于擴增試劑污染、耗材污染、實驗室氣溶膠污染等，解決的辦法就需要我們替換所有的實驗試劑，實驗耗材，對實驗室臺面和加樣槍進行去污染處理以及去除實驗室氣溶膠污染。
圖4：軟件提示D9、D10作為陰性對照孔有擴增。
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圖5：經查看原始數據的多組分圖，D9和D10孔確實是存在擴增，說明整個反應體系中有污染存在。
02
BADROX: Bad Passive reference signal， ROX作為參比熒光信號異常。Applied Biosystems??系列熒光定量PCR 儀器可以用ROX作為參比熒光染料，用以校正儀器系統以外的物理誤差，比如均一化由于移液分裝、蒸發、氣泡導致的批內體積誤差等。通常情況下，ROX作為參比熒光，在整個反應過程中熒光強度應該是保持不變的，因此，當反應擴增體系ROX 的熒光強度有明顯的變化時（algorithm result > 0.6 ），就會提示該質控提醒。引起ROX信號波動的常見因素有：反應管體系配制后上機檢測前沒有充分的離心，管壁上可能有小液滴的殘留，隨著反應的進行，這些小液滴又回流到PCR管底，導致ROX信號的波動；反應管體系配制后有氣泡存在，隨著反應的進行，氣泡在高溫下破裂，該過程也會導致ROX信號的波動（如圖6）；封板膜或者管蓋沒有蓋緊，導致反應過程中有體系的蒸發從而導致ROX信號的異常。如果這種提醒僅僅只是一兩個孔存在，那么在我們實驗中每個樣本有足夠重復的情況下可以選擇“Omit”這些異常的反應孔，反之，則需要重新進行實驗。
圖6：由于反應體系中有氣泡帶來的熒光信號波動，QC summary中提示BADROX。
03
SPIKE：Noise Spikes，擴增曲線的熒光信號并不是常見光滑的 “S” 型曲線，這是由于相鄰的兩個或者多個熒光信號數據點由于熒光強度波動較大導致擴增曲線呈現 “鋸齒狀” 、 “波浪形”。通常情況下我們可以手動調節基線或者閾值線的位置進行重新分析，如果調整分析之后Cт值依舊異常，則可以選中該孔，
04
NOISE：Noise higher than others in plate，該提示意味著該孔在擴增過程中相較于其他樣本孔存在較強的噪音信號。我們可以選中該孔，選擇查看擴增圖（Rn vs. Cycle and DRn vs. Cycle）和多組分圖，以及與正常的樣本擴增曲線進行比較查看。該提示的主要原因是因為反應體系中的擴增熒光信號或者參比熒光信號異常波動，波動的原因與上述“BADROX”中提到的原因相似，如果這種提醒僅僅只是一兩個孔存在，那么在我們實驗中每個樣本有足夠重復的情況下可以選擇“Omit”這些異常的反應孔，反之，則需要重新進行實驗，如果這種波動是在擴增的線性期或者平臺期，一般情況下不會影響我們對Ct值的判讀，則不需要重新進行實驗（如圖7）。
圖7：由于熒光信號異常導致的NOISE提示（B7孔，橙色擴增曲線），和C6孔（綠色擴增曲線）相比，熒光信號的波動主要是位于擴增的平臺期，一般不會影響我們對Ct值的判讀。
05
OFFSCALE:?Fluorescence is offscale, 熒光信號過強，超過了儀器的檢測上限。出現這種提示的原因主要有以下幾種情況：1. 反應體系中加入過量的引物、探針或者SYBR 染料，導致反應熒光強度過高而超過儀器的檢測上限，這種情況我們可以通過減少引物、探針或者SYBR 的用量來解決；2. 某個孔報錯提示為Offscale，這種情況大多是因為熒光物質污染了我們的反應板或者加熱模塊而引起的信號異常，需要我們對儀器進行背景校準，對儀器的加熱模塊進行清潔；3. 整個反應板都出現Offscale 提示，包括沒有加樣本的空孔，這種情況有可能是因為儀器光路采集系統有問題，需要聯系我們的技術支持或者工程師進行判斷、維護；4. 反應試劑中有其他的熒光物質干擾或者用了其他未校準的熒光染料?（圖8）。
圖8：客戶使用儀器未預先校準的染料而導致儀器出現“Offscale”提示，右側的熒光信號高達350萬熒光單位。
圖9：錯誤使用ROX濃度導致儀器出現“Offscale”提示, 在QuantStudio系列儀器上使用其他品牌的擴增試劑時，需要選用低濃度的ROX作為參比熒光。
06
HIGHSD：High standard deviation in replicate group，復孔之間的Cт值差異過大，此類型的質控提示是客戶數據中常見的問題之一。通常我們的qPCR會針對每個樣本進行3次以上的技術重復，根據每個復孔的Ct值計算出它們的標準差（Standard Deviation，SD），當復孔間的Ct值的標準差大于0.5時，軟件就會提示“HIGHSD”。這種大部分情況都是由于實驗操作不規范引起的，主要的原因包括：擴增體系配制之后，沒有充分的離心，管壁上有小液滴的殘留；反應的體系密封不當導致有蒸發；加樣不準導致復孔間的反應體積不一樣、某個復孔少加了某種反應試劑、配制好的擴增體系沒有充分震蕩混勻就分裝到每個孔中以及模板質量不好，待測樣本的濃度很低等因素（圖10）。
圖10：絕對定量實驗時遇到復孔（E2，E3，E4）之間Cт值差異大，其中一個復孔的Cт值相較于另外兩個復孔差異在3個Cт值左右，約等于10倍的濃度差異?？蛻裘看闻渲企w系都是用移液器吹吸混勻，懷疑是體系中試劑組分沒有混勻導致的，遂建議采用斡旋震蕩充分混勻、離心之后再分裝到qPCR反應管中，解決了復孔間Cт值差異過大的問題。
07
NOAMP：No amplification，待測樣本未擴增。當軟件提示“NOAMP”時，我們要對該提示的反應孔進行查看確認，首先要確認該孔是不是我們的陰性對照孔，其次通過查看擴增圖（Amplification plot）和多組分圖（multicomponent plot）確認該孔是否有熒光信號的增加。如果個別孔存在“NOAMP”提示，有可能是因為樣本本身質量不好或者濃度太低、或者是擴增的時候忘記加入某種組分導致擴增失敗，這種情況就需要重新對該樣本進行實驗；如果本次實驗包括陽性對照都出現未擴增的情況，那就要從試劑、擴增條件設置、以及儀器加熱模塊升降溫是否正常等方面進行問題排查。
08
NOSIGNAL：No Signal in well，根據字面意思我們不難理解這個提示告訴我們這個孔信號極低或者沒有信號。我們可以將該孔和其他正常樣本孔同時選中，在多組分圖中查看這兩個孔的原始熒光信號強度，如果發現標記熒光和參比熒光都接近為零，且和未標記的孔相比，在ROX信號強度上表現出較大的差異，則說明該孔就是一個空的反應孔，里面并未含有擴增試劑（如圖11）；如果發現參比熒光信號和正常的反應孔強度相似，但是標記熒光未抬升（如圖12），則說明該孔未發生擴增，需要去排查擴增失敗的原因。
圖11：H3孔多組分圖中可以看出ROX和SYBR熒光信號都接近于零，說明該孔是空孔，不含有擴增試劑。
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圖12：G5孔和G6孔中，ROX參比熒光的信號強度類似，但是G5孔中的SYBR沒有抬升，說明該孔未擴增，G6孔則是正常擴增。
09
OUTLIERRG：Outlier in replicate group，該項質控提示和上文講到的 “HIGHSD” 類似，反應的也是樣本技術重復之間的Cт值差異過大, 不同之處在于 “OUTLIERRG” 更偏向于說明在一組技術重復中存在某個復孔的Cт值偏離其他復孔的Cт 值，軟件是根據改良后的格拉布斯（Grubbs）法進行判斷，格布拉斯法是用于異常值判斷的數學算法。具體是指在一組測量數據中，如果個別數據偏離平均值很遠，那么這個(這些)數據稱作“可疑值”。數據分析的時候可以將該“可疑值”從此組測量數據中剔除而不參與平均值的計算。圖13中三個復孔的Cт值分別是: 25.94、25.96和25.17，經計算三個復孔之間的Cт SD值為0.45，盡管小于0.5，但是可以看出Cт值為25.17的樣本孔結果明顯偏離其他兩個重復的Cт值，根據Grubbs 法進行判斷之后，該值屬于異常值，那么就建議客戶在數據分析的時候將該值剔除從而確保結果的準確性。那么引起某個復孔Cт值偏差較大的原因有如下幾種可能：1. 該反應孔內有污染，污染來源于耗材或者氣溶膠等；2. 反應板密封不好，導致反應過程中擴增試劑有蒸發；3. 加樣誤差。
圖13：D10、E10、F10是一個樣本的三次技術重復，可以看到F10孔的Ct值為25.17。經過計算，屬于異常值，因此軟件提示OUTLIERRG。
10
EXPFAIL：Exponential algorithm failed，EXPFAIL表示指數期擴增失敗，選中該孔，查看擴增圖（Rn vs. Cycle and DRn vs. Cycle）和多組分圖，以及與正常的樣本擴增曲線進行比較查看。可能的原因有擴增太早、太晚、弱擴增或者無擴增，如果擴增曲線看上去沒有太大的異常，我們也可以手動設置基線和閾值線，然后選擇重新分析。圖14和圖15分別是擴增太弱或者擴增太早導致的EXPFALI，針對擴增太弱的樣本需要加大反應模板的起始量或者優化反應體系；針對擴增太早的樣本，通常是因為起始模板的濃度過高，建議稀釋之后再重新進行實驗。
圖14：由于擴增太弱導致軟件提示EXPFAIL，從多組分圖中可以看到SYBR的熒光信號沒有明顯的抬升。
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圖15：擴增太早導致軟件提示EXPFAIL，從多組分圖中可以看到在擴增的早期SYBR的熒光信號已經開始抬升。
11
THOLDFAIL：Thresholding algorithm failed，默認條件下，定量PCR軟件有自動設置基線和閾值線的功能，可以自動生成Cт值。這種計算方法得出的基線和閾值是建立在假設數據呈現出典型的擴增曲線的基礎上。實驗問題（例如污染、加樣不準確、錯誤使用ROX參比熒光濃度（圖16）等）會導致擴增曲線明顯偏離正常的擴增曲線。這種情況下，軟件自動設置基線以及閾值線的功能就會失敗，需要手動調整基線和閾值線。如下的案例是在我們StepOne Plus儀器上進行的定量實驗，實驗結束后發現沒有Ct值。經查看原始數據，在QC summary中有 “EXPFAIL”和“THOLDFAIL” 兩種質控提示（圖17）。查看擴增圖和多組分圖發現，本次實驗中多數樣本擴增很弱，這就導致我們的儀器在自動設置閾值線的時候就把閾值線設置的很低，Threshold 為0.0001（圖18），這個時候需要我們手動調節閾值線，再重新分析即可。
圖16：錯誤使用ROX濃度導致儀器質控提示：THOLDFAIL。我們可以選擇取消“ROX”作為參比熒光，然后重新分析。
圖17：StepOne Plus儀器上實驗結束后，質控提示部分孔存在 “EXPFAIL” 和 “THOLDFAIL” 。
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圖18：從擴增圖中我們可以看到，由于大多數樣本沒有擴增或者擴增很弱，導致軟件自動設置的閾值為0.0001，這個時候需要我們手動調整閾值。
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BLFAIL：Baseline algorithm failed，BLFAL表示軟件的基線期算法失敗。說明我們擴增曲線的基線期熒光信號異常，導致軟件沒有辦法劃分正確的基線起始點和終止點。以7500上的一次實驗為例：客戶反應部分樣本沒有Cт值，這些沒有Cт值的樣本均有提示 “BLFAIL” （圖19），選中這些樣本孔，查看多組分圖發現這些沒有Cт值的樣本基線期熒光信號特別低，接近于0（圖20）。正常來講，反應體系中加了熒光染料，即使沒有擴增也是有背景熒光的，這種背景熒光特別低的情況可能是客戶使用了透光性不佳的耗材或者沒有使用正確的反應適配器導致的，因此導致基線期熒光信號太低而基線期劃定失敗。
圖19：部分樣本顯示“BLFAIL”，這種情況通常是由于使用了透光性不好的耗材或者沒有正確的使用反應托架造成的。
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圖20：通過查看多組分圖，這些孔基線期的熒光信號都在0以下，因此導致軟件基線期?分析失敗。
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CTFAIL：Cт algorithm failed，CTFAIL表示軟件Cт值計算失敗，選中該孔，查看擴增圖（Rn vs. Cycle and DRn vs. Cycle）和多組分圖，以及與正常的樣本擴增曲線進行比較查看。可能的原因有擴增太早、太晚、弱擴增或者無擴增，如果擴增曲線看上去沒有太大的異常，我們也可以手動設置基線和閾值線，然后選擇重新分析即可。
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MTP：Multiple Tm peaks，有多個熔解-峰。選擇SYBR染料法進行qPCR實驗需要運行熔解曲線步驟以查看擴增產物是否單一。通常情況下，單一的熔解峰意味著擴增產物特異性好，而多個熔解峰就意味著有多個擴增產物。引起多個熔解曲線峰的原因有：1. 反應體系中有模板污染存在，需要我們更換試劑、耗材等并重新進行實驗；2. 擴增試劑不穩定，例如使用的擴增酶不是熱啟動酶且體系配制好之后沒有立刻進行PCR反應；3. 引物的特異性不好，導致擴增體系中有非特異性擴增或者引物二聚體，我們可以適當的增加退火溫度看是否有改善，或者選擇重新設計引物；4. PCR反應體系沒有進行優化，包括引物濃度、酶濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度、Buffer的組分、反應體系的pH值、擴增的循環數等。此外，多色探針法熔解曲線，高分辨率熔解曲線（HRM）以及蛋白熔解曲線（PTS）實驗，可能會涉及多個核酸產物/蛋白結構域，出現多個熔解峰通常是正常現象，忽略這個質控提醒即可。
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CLUSTER# ：Number of clusters outside expected range，這種提示通常在基因分型實驗中會出現，主要原因是SNP分型實驗需要根據擴增信號的強度通過聚類算法把樣本分為野生純合、雜合以及突變純合，因此最后的分型應該有3簇，大于3簇或者小于2簇都會出現CLUSTER#提示。出現分簇失敗的原因有：1. 檢測的SNP次要等位基因頻率（minor allele frequency ; MAF）太低，可以通過增加檢測的樣本量或者添加陽性對照來解決；2. 引物和探針的特異性不好，需要我們對探針或者引物序列進行優化；3. 反應中某個樣本出現異常結果從而被單獨的分為一個簇，這種情況下需要我們對該樣本重新進行實驗或者選擇忽略（Omit）該樣本然后重新分析。
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PCFAIL：Positive control failed，陽性樣本分型失敗，這種提示只有在基因分型實驗中出現，PCFAIL意味著在SNP分型實驗中我們的陽性參照樣本基因型和我們最終實驗呈現的基因型分類結果不一致。這種情況主要有以下幾種原因：1. 設置實驗時錯誤設置了陽性樣本的報告基團（例如：將FAM信號標記成了VIC信號），這種情況下我們可以在實驗結束之后在plate setup里重新更改報告基團的類型，然后選擇重新分析即可；2. 確定是否有加錯陽性樣本；3. 確認陽性對照的基因型是否正確；4. 反應體系中存在探針的非特異性結合，需要對引物/探針進行優化。
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SMCLUSTER：Small number of samples in cluster，該質控提示只存在于基因分型實驗中。在基因分型實驗中，軟件會根據實驗結果采用聚類法把樣本分為純合野生型、純合突變型以及雜合共3簇，當每簇分型的樣本數少于2個時就會有該提示，主要的原因可能有：1. 本次實驗樣本數量過少導致每簇樣本量不足2例；2. 本次實驗檢測的SNP 次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）過低，導致檢測到的某一種基因型樣本太少；3. 實驗中某個樣本檢測結果異常，導致軟件將其單獨分為一簇，這種情況需要我們對本次實驗分簇情況進行確認以及對該樣本進行重復實驗進行驗證。
以上簡單介紹了如何去查看qPCR軟件中Quality Control 部分的內容，介紹了每種質控提醒的含義、可能的原因以及如何去減少/避免。了解這些質控提醒的含義有助于我們規范自己的實驗操作以及對實驗結果更好的解讀。當然，大家在實驗過程中遇到的質控提醒原因可能不僅限于上述描述，如果仍然遇到解決不了的問題，也歡迎您聯系我們賽默飛的技術支持，我們將盡力給您提供幫助。
