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除了核酸，qPCR還能玩轉蛋白

德國耶拿生命科學部

2021.12.15

? ? ? ?全球性新冠疫情的爆發，讓以熒光定量PCR（qPCR）為核心的核酸檢測技術“出圈了”。殊不知，qPCR除了可以擴增檢測核酸外，對蛋白質的研究也有獨到之處。

? ? ? ?做蛋白質研究，如何確保蛋白質穩定性是繞不開的課題。蛋白質的穩定性一般取決于和配體的相互作用、緩沖液條件以及構象的變化，要摸索優化這些條件非常耗時費力。如果我們把qPCR的核酸熔解曲線實驗原理轉移到蛋白質研究中，就可以很方便地在熒光定量PCR儀上通過蛋白質熱漂移Thermal shift實驗進行蛋白熱穩定性的研究，只需把核酸熒光染料換成蛋白質標記常用的SYPRO Orange即可。

? ? ? ? SYPRO Orange熒光染料是一種自然猝滅的染料，蛋白質變性后，它能高效地結合到暴露出來的蛋白質疏水核心，進而發生熒光信號的增強。蛋白質在不同狀態下，其熔解溫度Tm會有不同，通過比較不同條件下蛋白質Tm值的變化，便可知道蛋白質是否發生變性。該方法操作簡單，靈敏度高，反應快速，是拓展熒光定量PCR儀應用的一個新方向。

圖1、SYPRO Orange 結合蛋白質疏水核心，進而發出熒光信號

圖2、蛋白質熔解曲線原理示意圖

? ? ? ?我們以一個簡單的實驗案例來看一下，如何用熒光定量PCR儀檢測蛋白質熱穩定性。本實驗研究的目標蛋白質是溶解在TBS中的α-胰凝乳蛋白酶原A，檢測在3種濃度不同的NaCl溶液下，其蛋白Tm值的變化情況。

表1、樣品反應體系的配置（20μl /孔，每種NaCl濃度3個復孔）

圖3、蛋白質熔解曲線反應程序（以耶拿qTOWER3G為例）

實驗結果：

圖4、三種NaCl溶液下的α-胰凝乳蛋白酶原A的熔解曲線：20 mM（灰色）、500 mM（黑色）、2 M（紅色）

表2、三種NaCl溶液下的熔解溫度Tm值

結論：

? ? ? ?從熔解曲線的結果可以明顯看出，隨著NaCl溶液濃度的提高，α-胰凝乳蛋白酶原A的熱穩定性也隨之提高，20 mM時的Tm值為49℃左右，2 M時的Tm值在55℃左右，Tm值大約漂移了6℃。我們還可以進一步探討引起熱穩定性提高的原因，比如說較高的鹽濃度可導致α-胰凝乳蛋白酶原A的水化殼的形成，由此提高了蛋白穩定性。

? ? ? ?蛋白質熱漂移實驗是檢測蛋白質熱穩定性的簡便快速的方法，有助于評估蛋白質配體結合、最佳緩沖液條件或分析蛋白質構象變化等。

? ? ? ?熒光定量PCR儀是開展蛋白質熱漂移實驗的優選工具。

? ? ? ?1. 高通量：可同時進行96個乃至384個樣品的檢測。

? ? ? ?2. 檢測快速：反應時間只需要十來分鐘。

? ? ? ?3. 操作簡單：反應體系的配制比qPCR實驗還簡單，反應程序只需調用熔解曲線。

? ? ? ?4. 低成本：SYPRO Orange是易獲得的常規的熒光染料。

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? ? ? ? 當然，并不是所有熒光定量PCR儀都適合做蛋白質熱漂移實驗，還需要考慮重要的兩個方面：

? ? ? ? 1. 儀器上必須要裝配有專用于SYPRO Orange的檢測通道。

? ? ? ? 2. 儀器的溫控精準度必須要高，能有效區分開不同情況下蛋白質Tm值的差異。

? ? ?德國耶拿公司出品的熒光定量PCR儀qTOWER3系列，能根據客戶需求靈活配置檢測通道，提供專門的SYPRO Orange蛋白檢測通道，溫度準確性±0.1℃，溫度均一性±0.15℃，中文軟件簡單直觀，是開展蛋白質熱漂移實驗的理想之選。

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