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解決方案|高效液相色譜法測定奶粉中的三聚氰胺
前言
三聚氰胺是一種重要的化工原料，是作為塑料、涂料等行業的改性劑。普通的全氮測定法測奶粉等食品中的蛋白質含量時不能排除偽蛋白氮的干擾，一些違法企業為了提高產品中的蛋白質含量將三聚氰胺作為偽蛋白質非法添加到食品、飼料等產品中。實驗研究結果顯示，雖然三聚氰胺本身毒性輕微，但它一旦與氰尿酸結合后會造成腎中毒，嚴重影響人類健康。
三聚氰胺的檢測方法通常有液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法、氣相色譜-質譜法等。本文根據國家標準GB/T 22388-2008 《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》，建立了利用高效液相色譜LC-5520測定奶粉中三聚氰胺的方法，供相關人員參考。
LC-5520液相色譜儀
PART ONE
實驗部分
實驗原理
將試樣用三氯乙酸溶液—乙腈提取，經陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測定，外標法定量測定三聚氰胺的含量。
儀器設備與試劑
LC-5520?液相色譜儀（紫外檢測器）；
AS-405?自動進樣器；
DM-101?在線脫氣機；
陽離子交換固相萃取柱：(SCX，Agilent Technologies);
甲醇（色譜純）；
乙腈；
氨水：含量為25%～28%；
三氯乙酸；
檸檬酸；
辛烷磺酸鈉；
三聚氰胺標準品。
實驗條件
色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；
流動相：離子對試劑緩沖液-乙腈（90+10，體積比）；
流??速：1.0?mL/min；?
檢測波長：240 nm；
柱溫：：室溫；
進樣量：20 μL。
樣品處理
提取?
稱取2 g（精確至0.01 g）試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于4000 r·min-1離心10min。上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。
凈化?
將待凈化液轉移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1mL·min-1。洗脫液于50 ℃下用氮氣吹干，殘留物（相當于0.4 g樣品）用1 mL流動相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜后，供HPLC測定。
PART TWO
實驗結果
標準譜圖
圖1?三聚氰胺標準樣品線性色譜圖
標準曲線的繪制
待儀器穩定后，將標準溶液按濃度由低到高進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標準曲線如圖2。線性方程，相關系數如表1所示。
圖2?三聚氰胺標準曲線
樣品分析
空白試驗
除不稱取樣品外，均按上述測定條件和步驟進行。空白樣本的色譜圖見圖3。
圖3?空白樣本色譜圖
空白實驗樣本中未檢出三聚氰胺。
試樣測定
根據《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》規定，HPLC的定量限為2 mg·kg-1。某品牌奶粉在重復性條件下，獲得三聚氰胺兩次獨立測定結果如下，見表2、圖4、圖5。
圖4 樣品第一次獨立測定色譜圖
圖5 樣品第二次獨立測定色譜圖
由圖2可知，三聚氰胺標準樣品的保留時間在32min左右，樣品譜圖中在32min左右未出三聚氰胺的色譜峰，因此可判斷樣品中未含三聚氰胺。
回收率
在樣品中分別添加2 mg·kg-1、6 mg·kg-1和 10 mg·kg-1三聚氰胺標準品，做回收率實驗。
在添加濃度2 mg·kg-1-10 mg·kg-1濃度范圍內，回收率在85.45%～92.77%之間。
PART THREE
實驗總結
本文根據國家標準GB/T 22388-2008 《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》，建立了利用高效液相色譜LC-5520測定奶粉中三聚氰胺的方法。該方法具有成本低，不需要衍生、操作簡單易行、批次重復性好、回收率高、重現性好等優點。本實驗注意：三聚氰胺呈弱堿性，凈化過程一般選擇陽離子交換柱；通過兩種不同溶液洗滌（水和甲醇），使樣品更干凈，從而提高檢測靈敏度；在能得到較好的分離度結果的前提下，為了縮短分析時間可以適當提高流動相中乙腈的比例。
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