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mRNA藥物的關鍵質量屬性分析

徠卡顯微系統

2021.12.20

mRNA藥物是通過將編碼抗原蛋白的mRNA接種到人體，利用人體細胞內的遺傳物質進行表達合成抗原蛋白，通過抗原蛋白誘導和激活機體的免疫系統產生免疫反應，從而達到預防和治療疾病的目的。由于其具有較低的感染和突變風險，能夠同時誘導產生體液免疫和細胞免疫，免疫效能好，研發和生產周期短，容易實現量產等特點，目前被廣泛用于傳染性疾病、腫瘤及罕見病藥物的研發。

mRNA疫苗的作用機制

（圖片來源：NATURE REVIEWS | Drug Discovery）

mRNA藥物在研發過程中，其穩定性和藥物遞送是需要面臨的主要挑戰。裸露的mRNA很容易受到體內RNA切割酶的攻擊，mRNA也需要被高效地遞送至細胞內從而進行翻譯，發揮功能。因此，mRNA藥物的關鍵技術為RNA的修飾與遞送。

mRNA藥物前期的研發工作主要集中在修飾 mRNA 的結構元件上，特別是5’帽區，5’UTR 和 3’UTR，編碼區和Poly A 尾，修飾此類結構能有效改善 mRNA 在細胞內的穩定性和翻譯效率。除此之外，對mRNA的結構進行表征分析，也是保證 mRNA 安全性和有效性的關鍵。

mRNA藥物的結構

（圖片來源：NATURE REVIEWS | Drug Discovery）

加帽率及Poly?A 尾檢測

在mRNA的結構表征上，丹納赫生命科學擁有使用SCIEX高分辨質譜及毛細管電泳進行檢測的方案。由于mRNA全長較長、分子量較大，所以在進行加帽率及Poly A 尾檢測時，需要通過酶切的方式獲得5’端的加帽短鏈及3’端的Poly A尾短鏈，然后分別進行毛細管電泳及質譜的檢測。

mRNA加帽檢測前處理

PA 800 Plus毛細管電泳制藥分析系統可以分離獲得加帽和不加帽樣本的分離峰，目前經過優化，基本可以得到達基線分離，從而可以獲得準確的加帽定量檢測結果。對于100nt以內的單鏈核酸，PA 800 Plus可以分辨相差1nt的產物，從而對Poly A 尾進行檢測。

PA 800 Plus毛細管電泳制藥分析系統

對mRNA樣本進行加帽率檢測

PA 800 Plus分離pd(A) 40-60 Test Mix

采用SCIEX的高分辨質譜ZenoTOF? 7600系統進行檢測，根據精確分子量，不但能檢測加帽和不加帽的樣品，還能區分不同的Cap種類。同時質譜還能進行Poly A的長度分布表征及相對定量。由于核酸表征分析需要加入離子對試劑，這對質譜的抗污染能力提出了很高的要求。

高分辨質譜對mRNA樣本進行加帽率檢測

mRNA純度及完整性分析

mRNA在制備、加工、配方和長期儲存過程中可能會發生降解，因此通過對mRNA的純度及完整性分析，對于產品質量保證和優化制造工藝至關重要。使用PA 800 Plus匹配LIF檢測器可有效的依據mRNA片段大小來進行高分辨率的分離和高靈敏度的檢測，該方法適用的mRNA范圍較廣，可進行0.2 kb-10.0 kb范圍內的分析。

PA 800 Plus對mRNA長度完整性進行檢測

合適的mRNA遞送載體可實現對mRNA的高效包載，并在體內實現良好的表達效果。基于脂類或類脂化合物的載體是目前mRNA疫苗最常用的非病毒類載體。各種合成的和天然衍生的脂質已經被用來形成脂質體或脂質納米顆粒（LNP），兩者都被報道可以有效地遞送基于mRNA的疫苗。

無論是脂質體或是脂質納米顆粒包裹mRNA后的顆粒大小、粒徑分布等都是影響遞送效率的最主要的參數，丹納赫生命科學擁有對載藥脂質體進行不同維度檢測的方案。

載藥顆粒形態學觀察

采用冷凍透射電鏡進行載藥脂質體的檢測可以直觀地觀察脂質體的分布形態、顆粒大小和顆粒完整度，并且冷凍處理載藥脂質體是在生理狀態下對載藥脂質體進行冷凍保存，不會對脂質體造成破壞，所獲得的結果更加真實、清晰、準確。徠卡顯微系統擁有全套的冷凍制樣設備，包括對電鏡載網的噴鍍連續碳膜和輝光放電處理的EM ACE600，以及能夠實現對樣品安全冷凍的投入冷凍儀EM GP2，可以便捷地完成高質量的載藥脂質體的冷凍前處理。

載藥脂質體冷凍透射電鏡圖

Leica 載藥脂質體冷凍前處理技術路線

載藥脂質體包封率檢測

另外，還可以采用分析型超速離心機對載藥脂質體的顆粒大小分布進行檢測，并計算游離與膠囊化藥物的比例，為脂質體或是脂質納米顆粒與mRNA藥物的混合比例提供指導。采用分析型超速離心機進行載藥脂質體檢測的優點是：使載藥脂質體保持天然狀態，沒有破壞性，并且檢測完后可回收。

貝克曼庫爾特分析型超速離心機（AUC）

對載藥脂質體進行檢測

載藥脂質體粒度分布檢測

粒度分布是指在一定的粒徑檢測范圍內，對脂質體顆粒的大小進行分析，得到粒徑分布圖和相應的粒徑分析結果（包括中位粒徑D50，平均粒徑Mean Diameter），以此控制生產的脂質體顆粒大小，以及用于生產質控，保證批次間的一致性。因為粒度分布可影響納米載體體內分布從而影響被動靶向，所以是檢測載藥脂質體的重要指標。貝克曼庫爾特的LS 13320 XR 激光粒度分析儀采用先進的偏振光強度差散射（PIDS）技術與激光衍射相結合，可對納米級別的載藥脂質體粒度分布進行精確檢測。

LS 13320 XR 激光粒度分析儀對脂質體進行粒度分布檢測

細胞外囊泡的檢測

體液中的細胞外囊泡（EV）是由多種細胞分泌的攜帶有核酸、蛋白質和脂質等物質的一種納米囊泡，在體內可發揮細胞通訊和物質傳遞的作用。因其具有良好的生物相容性、高生物滲透性和低免疫原性、低毒性等優點，被越來越多地用于mRNA藥物的遞送系統的研究。

流式細胞儀可以對EVs和其他生物顆粒（包括病毒和細菌）進行定量和多參數表征。但實際上，最靈敏的傳統流式細胞儀已被認為無法檢測到直徑小于300納米的EVs。由于微泡大小的范圍實際上延伸至150 nm，而外泌體的直徑在30–150 nm之間，因此這導致了一個共同的認知，即流式細胞儀只能檢測到EVs的冰山一角。

貝克曼庫爾特的CytoFLEX系列流式細胞儀是一種基于半導體集成電路化的流式細胞儀，將硅雪崩光電二極管（APD）與波分復用（WDM）結合，優化的流通池設計和二極管激光器配對使信號強度遠大于傳統流式細胞儀，而噪聲遠遠小于傳統流式細胞儀。另外，CytoFLEX上的紫色SSC（VSSC，405 nm）充分提高了小顆粒檢測的靈敏度。