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10 分鐘？就能獲得檢測病毒誘導的細胞病變效應的實驗結果？
一、病毒感染細胞
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病毒感染細胞的過程
自 2020 年初新冠疫情席卷全球以來，新冠病毒在人群中大肆傳播，改變了大家平靜的生活。病毒屬于非細胞型生物，個體微小，結構簡單，由一種核酸（ DNA ?或? RNA）與蛋白質外殼構成。病毒本身不能進行新陳代謝，只能在活細胞內寄生并以復制方式增殖。那么病毒是如何侵染細胞的呢？首先病毒與正常細胞接觸，病毒外殼與細胞的細胞膜（上面有糖蛋白）融合，病毒將其遺傳物質注入到細胞內，并利用細胞的物質復制其遺傳物質和蛋白質外殼，然后在細胞內組裝，最后漲破細胞（細胞死亡）回到細胞外，如此循環1?。
02
病毒感染引起宿主細胞的變化
病毒的致病機制分為對宿主細胞的直接作用以及免疫病理作用。病毒感染哺乳動物細胞通常會對細胞造成明顯的影響，如活力、形狀或大小的改變，或與鄰近細胞融合。這些變化被稱為細胞病變效應（ Cytopathic Effect ?, ?CPE ）2。基于不同種類的病毒感染宿主細胞的形式以及感染細胞后產生的效應不同，可以將病毒分為四類：致細胞變性的病毒，致包涵體形成和細胞變性的病毒，致細胞融合形成多核細胞的病毒，以及不導致 CPE ?的病毒3。病毒的早期蛋白會影響宿主細胞大分子的合成，病毒蛋白（如衣殼蛋白）會對宿主細胞產生毒性作用，引起細胞內溶酶體膜破裂，導致細胞自溶。病毒會對細胞的細胞器造成損傷，某些病毒的溶血素會引起細胞溶解以及細胞的免疫病理損傷。常見病毒的細胞病變效應包括：使宿主細胞變圓，折光性增加，細胞局部或全層發生死亡脫落（如腸道病毒）。使宿主細胞變圓或膨大，聚集成叢，似葡萄串狀，細胞間常有細絲狀間橋連接（如腺病毒）。使宿主細胞發生細胞融合形成多核的巨細胞，稱為“合胞體”（如副粘、牛白血病病毒等）。使宿主細胞胞漿內形成空泡（如猴病毒? SV40 、呼腸孤病毒等）。可以通過光學顯微鏡或成像系統對細胞病變效應進行評估，或者使用更多的定量檢測手段對其進行測定。
03
病毒感染力檢測方法
目前最常用的病毒定量檢測方法有以下三大類：
（ 1 ）直接對病毒顆粒進行計數的方法，如流式細胞分析和透射電鏡技術；
（ 2 ）病毒核酸和病毒蛋白檢測技術，如實時定量多聚酶鏈反應（? qPCR ?），免疫印跡，免疫沉淀，酶聯免疫吸附測定（? ELISA ?）和血凝試驗等；
（?3 ）用于病毒感染力檢測的技術，如病毒空斑形成試驗，半數組織培養感染劑量? TCID50??測定和免疫熒光檢測等。病毒鑒定和定量檢測的方法很多，但每種方法均存在一些局限性，如重復性差，時間長，工作量大，費用高等，目前人們仍在尋找和發展新的更為優化的病毒鑒定和定量檢測方法。
病毒感染十分常見，病毒感染力檢測是病毒定量常用的方法。病毒感染力檢測不僅可以用于臨床疾病的評估，也可以用于流行病學的調查，為病毒性疾病的預防和治療提供科學依據。常用的病毒感染力檢測的方法包括病毒空斑試驗，量反應檢測法（? TCID50??,? LD50? ?,? ?EID50 ?）以及免疫熒光試驗（? IFA ?)。
病毒空斑試驗
病毒空斑試驗是使用最廣泛的病毒定量檢測方法之一?4 ?。通過計數不同稀釋度下的空斑形成數量可以知道每毫升病毒顆粒數或每毫升空斑形成單位（ PFU ?）。由于每個空斑來自于起初的一個病毒顆粒，因此可以從單個空斑中純化得到來源于單個克隆的病毒種群。細胞空斑試驗對細胞狀態要求比較高，而且比較費時。
量反應檢測法：TCID50? ,??LD50? ?,? ?EID50
病毒空斑試驗對于確定病毒滴度非常有用，但是有些病毒在培養時不能形成空斑。這些病毒感染細胞后不會造成細胞死亡，但會讓細胞發生細胞病變效應（CPE ），可以用? TCID50? ?,??LD50? ,??EID50??等方法進行檢測3。半數組織感染劑量? TCID50??是指使一半的單層細胞培養發生細胞病變的病毒量，TCID50??檢測法被廣泛地應用于流感病毒，人類皰疹病毒，? HIV-1 ?等各種病毒的試驗研究以及臨床診斷中。此外，可以通過終點稀釋法將病毒懸液感染動物來確定病毒的滴度。如果病毒導致動物死亡或殘廢，相應的結果可用每毫升半數致死劑量（? LD50??）或每毫升半數致殘劑量（? PD50??）來表示。
免疫熒光檢測法
（ immunofluorescence assay? IFA ）
針對不能形成空斑或者不能導致明顯? CPE? 效應而無法確定其? TCID50??的病毒，免疫熒光檢測法（? IFA ）是一種確定病毒滴度的快速檢測方法5。IFA ?主要利用抗體染色的方法，因此該檢測方法成本較高。而且容易由于非特異性結合導致染色背景較高，實驗結果不準確。
二、使用微孔板讀板機
定量檢測病毒誘導的細胞病變效應
由于病毒誘導的細胞病變效應（ CPE ?）會耗盡細胞中的? ATP ?，導致發光信號的減少，因此可以通過微孔板讀板機定量檢測宿主細胞中病毒誘導的? CPE ?。? Viral ToxGlo ?檢測試劑盒（? Promega ?公司）可以檢測活細胞中存在的? ATP ，并提供一種簡單的發光檢測方法來定量細胞活力。研究采用了兩種病毒感染模型:?甲型? H1N1 流感病毒6??感染? Madin-Darby? ?犬腎（ MDCK ）細胞，人冠狀病毒株? 229E（HCoV-229E）7??感染? ?MRC-5 ?人肺成纖維細胞。將兩種具有抗病毒作用的化合物利巴韋林8??和瑞德西韋9??應用于暴露于病毒的細胞，并測定其抗病毒效力。在? SpectraMax ?iD5 ?多功能微孔板讀板機上使用簡單的混合讀取工作流程，并使用? SoftMax Pro ?軟件進行分析，即可輕松地獲得試驗及分析結果（圖? 1 ?）。包括測定病毒感染的哺乳動物細胞中的病毒感染力和TCID50，以及測定化合物的抗病毒效力。
01
優勢?
??簡單的混合和讀取方法，添加試劑后僅需 10 分鐘即可獲得結果
? 適用于篩選的穩定、靈敏的發光讀數
?使用 SoftMax Pro 軟件自動生成數據和分析結果
圖 1 Viral ToxGlo 檢測工作流程。
02
檢測方法
TCID50? 測定
病毒感染力和組織培養感染劑量（? TCID ?）的測定可以通過制備病毒原液的系列稀釋液，并將這些稀釋液添加到目標細胞中暴露特定的時間來確定。在暴露結束時，使用? Viral ToxGlo ?可以測定細胞活力的指標? ATP ?。TCID50? ?被用于后續對抗病毒藥物效力的研究。在? ?SpectraMax iD5 ?微孔板讀板機上讀取數據，試驗設置如表? 1 ?所示。使用 SoftMax Pro 軟件中的 4 參數曲線擬合將結果繪制為 RLU 與病毒稀釋因子的曲線，并從這些曲線中獲得每種病毒在其各自細胞系上的? ?TCID50? ?值（圖? ?2 ?）。
表 1 使用? SpectraMax iD5 微孔板讀板機
進行? Viral ToxGlo ?檢測的參數設置。
復方抗病毒效力的測定
為了評估化合物利巴韋林和瑞德西韋在降低病毒處理細胞的細胞病變效應方面的有效性，將? ?MDCK ??或? ?MRC-5 ??細胞接種在培養基中，細胞在培養箱中附著和過夜生長。細胞與病毒和化合物孵育后，將? ?Viral ToxGlo ATP ??檢測試劑加入檢測孔中，并將微孔板在室溫下孵育? 10? 分鐘，使細胞裂解。在? ? SpectraMax iD5 ?微孔板讀板機上讀取發光信號（設置，見表 1 ）。使用? ?SoftMax Pro ??軟件中的 4 參數曲線擬合將結果繪制為? ?RLU ?與化合物濃度的曲線，并從曲線中獲得每種化合物的? ?EC50? ?值（圖? 3 ?）。
( A )
?( B )
圖 2? H1N1 病毒在 MDCK 細胞上的濃度-反應曲線（ A ）
和? HCoV-229E 在 MRC-5 細胞上的濃度-反應曲線（ B ）。
( A )
?( B )
圖 3 ?利巴韋林對 MDCK 單獨或加入 H1N1 病毒的脫靶 (綠色)?和靶向 (紅色)?效應（ A ）。瑞德西韋對 MRC-5 單獨或加入 HCoV-229E 病毒的脫靶 (綠色)?和靶向 (紅色)?效應（ B ）。利巴韋林? EC50?= 89 μM ；瑞德西韋 EC50?= 215 nM。
總結
與耗時的顯微鏡下評估病毒感染對細胞活力的影響相比，利用微孔板讀板機進行定量檢測病毒誘導的細胞病變效應快速、簡便、經濟且準確。將試劑加入處理過的細胞中，只需 ?10 ?分鐘即可對結果進行檢測和分析。SpectraMax ?iD5 多功能微孔板讀板機可提供對該測定方法的高靈敏度檢測，SoftMax Pro ?軟件可輕松測定 ?TCID50? 及抗病毒化合物的靶向和脫靶效應。
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