人單核細(xì)胞白血病(THP-1)細(xì)胞培養(yǎng)攻略
THP-1細(xì)胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系。它來(lái)自一位急性單核細(xì)胞白血病患者的血液，有分化為多種巨噬細(xì)胞的能力，是各領(lǐng)域研究常用的細(xì)胞系之一。
THP-1是人外周血的單核細(xì)胞系，最初來(lái)源于急性單核細(xì)胞性白血病患者。屬于懸浮細(xì)胞，適合用于轉(zhuǎn)染或感染實(shí)驗(yàn)。其表面抗原HLA型為：A2，A9，B5，DRw1，DRw2。
|? 細(xì)胞復(fù)蘇
1. 預(yù)熱水浴鍋至37℃
2. 準(zhǔn)備一個(gè)15mL離心管，加入2-3mL左右完全培養(yǎng)基待用
3.?將細(xì)胞從-80℃冰箱或液氮中取出后，放進(jìn)一次性PE手套中，立即投入水浴鍋，迅速用力搖晃管子，使其1分鐘內(nèi)融化
4.?酒精擦拭凍存管，進(jìn)入生物安全柜，把融化的細(xì)胞懸液緩慢滴加到步驟2準(zhǔn)備好的離心管中
5.?1200rpm（約250g）離心3分鐘
6.?同時(shí)準(zhǔn)備1個(gè)新的T25培養(yǎng)瓶，加入5mL完全培養(yǎng)基
7.?去上清，新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后滴加到步驟6的培養(yǎng)瓶里，放入培養(yǎng)箱
小貼士：THP-1細(xì)胞復(fù)蘇后通常需要3-5天恢復(fù)狀態(tài)，建議復(fù)蘇后48小時(shí)內(nèi)不要進(jìn)行操作。
|?細(xì)胞凍存
1. 預(yù)先配制好凍存液
【推薦海星 HyCyte?一步凍存液 (即用型、無(wú)血清、無(wú)需程序降溫)】
2.?細(xì)胞1200rpm（約250g）3分鐘離心后
3. 去上清，用配好的凍存液重懸細(xì)胞
4. 轉(zhuǎn)移入凍存管
5.?凍存管放進(jìn)程序凍存盒
6.?凍存盒放進(jìn)-80度冰箱過(guò)夜，再放液氮長(zhǎng)期保存
小貼士：由于THP-1是懸浮細(xì)胞，更易受到凍存影響，建議加大凍存密度，大約200萬(wàn)-300萬(wàn)/mL為宜，以提高復(fù)蘇存活率。
|?培養(yǎng)條件
培養(yǎng)基：RPMI-1640+10%FBS+0.05 mM β-mercaptoethanol+1%P/S
推薦傳代比例：1:3-1:6，每2-3天換液一次
培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%CO2，溫度：37℃
|?傳代操作
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約8x10^5cells/ml左右時(shí)，即可進(jìn)行傳代。由于是懸浮細(xì)胞，可直接將細(xì)胞吸出，離心之后傳代。傳代最少濃度不應(yīng)少于1x10^5 cells/ml。
去掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入PBS進(jìn)行沖洗，并去上清;
加入胰酶進(jìn)行潤(rùn)洗，并去上清;
放入CO2培養(yǎng)箱消化2-4min;
加入完全培養(yǎng)基終止消化，并吹打均勻。
|?常見問(wèn)題
1. 收貨時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)偽足，或是碎片較多怎么辦？
受到運(yùn)輸影響，懸浮細(xì)胞會(huì)短暫性出現(xiàn)形態(tài)改變的現(xiàn)象，如偽足等。通過(guò)傳代培養(yǎng)，1周左右可以恢復(fù)正常。一些細(xì)胞在運(yùn)輸途中死亡而產(chǎn)生碎片，通過(guò)傳代離心可以去除（見上文傳代篇）。
2. 培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生貼壁怎么辦？
少量細(xì)胞貼壁屬于正常情況，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新瓶中即可。當(dāng)貼壁細(xì)胞的比例高于20%，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境有異常，需排查培養(yǎng)箱設(shè)置、培養(yǎng)基成分，以及培養(yǎng)器皿是否異常。
3. 培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生聚團(tuán)怎么辦？
少量細(xì)胞聚團(tuán)，呈葡萄串狀，屬于正常現(xiàn)象，特別是細(xì)胞密度較低時(shí)，易出現(xiàn)這種情況。更換血清品牌或增大血清比例（不超過(guò)20%）有助于解決聚團(tuán)問(wèn)題。不建議將聚團(tuán)的細(xì)胞吹散，等待密度高時(shí)，會(huì)自己分散開。
4. 培養(yǎng)基里一定要加β-巰基乙醇嗎？
β-巰基乙醇是一種常用的培養(yǎng)補(bǔ)充劑，有抗氧化的作用，可減少氧化應(yīng)激對(duì)THP-1細(xì)胞的影響。當(dāng)細(xì)胞密度過(guò)大但需要維持時(shí)，可適當(dāng)增加巰基乙醇的比例（不超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)量的1.5倍）。
5. 鏡下觀察時(shí)，難以聚焦或估算密度怎么辦？
懸浮細(xì)胞會(huì)隨著液體流動(dòng)，不容易聚焦，靜置5-10分鐘使細(xì)胞沉底，之后在輕輕放上顯微鏡觀察，將有助于聚焦和估算細(xì)胞密度。
|?注意事項(xiàng)
1. 細(xì)胞養(yǎng)不好，可能的原因有，THP-1細(xì)胞特別依賴細(xì)胞濃度，ATCC上10 5到106每ML，是一個(gè)很高的密度，細(xì)胞少了就不太容易養(yǎng)好。
2. 細(xì)胞株的來(lái)源很重要，如直接來(lái)源于ATCC（American Type Culture Collection 美國(guó)模式菌種保藏中心）生命力要強(qiáng)于國(guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù)的。
3. 注意細(xì)胞的密度一定要高，介于5×10^5—— 10^6/mL之間，增值的快。細(xì)胞數(shù)量太少，不適合THP-1生長(zhǎng)，一般狀態(tài)不好的THP-1在培養(yǎng)了3天后數(shù)量仍然不多，繼續(xù)培養(yǎng)一天或者兩天，培養(yǎng)基 嚴(yán)重泛黃，細(xì)胞數(shù)會(huì)增加。這一點(diǎn)不同于同是單核細(xì)胞系的U937細(xì)胞。
4. THP-1細(xì)胞適合在細(xì)胞Ph環(huán)境偏酸性環(huán)境生長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)基變化非常敏感，所以 盡量使用相同Ph的1640。
5. 傳代后切忌常移出培養(yǎng)箱觀察，否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，狀態(tài)變差，一般首先表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒變多。一般THP-1 生長(zhǎng)相當(dāng)快，對(duì)于狀態(tài)已經(jīng)不好的情況，建議傳代后3～4天再觀察，一般4天時(shí)間培養(yǎng)基已明顯泛黃，細(xì)胞數(shù)量巨增;1)THP-1細(xì)胞喜歡酸性條件，你不要老是換培養(yǎng)基。越酸的條件，細(xì)胞密度越大，細(xì)胞就長(zhǎng)得越好;2）不要頻繁換液，一般2-3次換液離心一次（只是補(bǔ)充培養(yǎng)基）3） 使用1640（ATCC推薦），注意加碳酸氫鈉2.5g就可以了，寧酸勿堿; 4）注意凍存的時(shí)候密度大些，推薦用血清凍存。
6. 復(fù)蘇比較慢，建議開始用小瓶，不要用一次性的。
