靜水深流：沃特世Q-Tof和IMS的前世今生
20多年前，沃特世推出全球第一臺商品化Q-TOF質譜；2006年，沃特世推出全球第一臺行波離子淌度質譜（IMS）。在Q-TOF推出20周年、離子淌度質譜推出10周年之際，分析測試百科網編輯采訪了沃特世公司質譜產品市場總監舒放先生。如果把成功的產品比作海面上壯麗的冰山，那么質譜前輩們數十年來不斷的創新與研發就是水面下的寶藏。人們常說，讀史明智，希望此文可以激勵今天的研發和應用創新者們，讓科學儀器為我們創造更美好的明天。
沃特世公司質譜產品市場總監 舒放
從磁質譜聯動掃描到Q-TOF的20年
眾所周知，沃特世于1996年收購了位于英國曼徹斯特的Micromass公司（前身是VG公司）。VG Micromass公司成立于1968年，當年推出MM1固定磁場小型質譜，主要用于殘余氣體分析；1970年推出Q7四極桿質譜，質量范圍達到120 Da；1974年推出第一臺磁質譜70-70，分辨率達到20,000，這是第一臺用做有機分析的雙聚焦高分辨質譜。
磁質譜的聯動掃描
1974年 MM 70-70F質譜儀具有聯動掃功能
70-70雖然是高分辨的雙聚焦質譜，但仍然是單級質譜，多個母離子和子離子混合在一起無法獲得清晰的結構信息。隨后的研究發現離子在到達檢測器之前通過磁場、靜電場和三個無場區，有些母離子會在飛行途中的無場區發生斷裂，這些離子被稱作亞穩離子。研發者發現當磁場和靜電場按一定的比例關系如B2/E聯動掃描時，可以偏轉掉其它離子而只檢測在無場區斷裂的離子，獲得亞穩離子譜圖。這種譜圖類似于MS/MS譜圖，只有一個母離子和由該母離子產生的子離子，從而可以研究分子結構。
亞穩離子是在無場區漂移的過程中自行斷裂的，所以靈敏度比較低。為提高靈敏度，1976年，研發者在磁場和靜電場之間添加了一個碰撞室（CID），碰撞室內加上氣體可以主動讓母離子碰撞碎裂，這樣就可以通過磁場高分辨選擇母離子，再通過靜電場檢測CID碎裂后的子離子，類似于現代MS/MS串聯質譜。1976年Micromass/VG推出商品化儀器MM Zab-2F，這是第一臺帶CID-MIKES碰撞功能的商品化高分辨質譜。
1976年，MM Zab-2F B-CID-E，具有CID-MIKES功能
B-CID-E 雖然對母離子的分辨率很高，但對子離子的分辨率很低。為了提高子離子的分辨率，研發者在磁質譜后串聯一個四極桿Q，中間再加一個碰撞室，這樣就得到了一個高分辨的母離子和單位質量分辨的子離子，這就是1985年推出的70S，這是真正意義上的串聯質譜MS/MS。
1985年，MM 70S，第一臺商品化B/Q MS/MS
MS/MS儀器的出現引起了很多科學家們的興趣，他們的理想要求是既要高分辨的母離子，又要高分辨的子離子。為了達到這些“土豪們”的要求，研發者開始為他們定制儀器，即把兩臺高分辨磁質譜串聯在一起，其間加一個碰撞室。“可以想象，這套儀器體積龐大，儀器大概有9米長，操作也非常困難。”舒放說，“不過這些‘土豪級’用戶的確用這些儀器取得了很多成果。”這樣就出現了AutoSpec 6F, AutoSpec-T.Zab-4F, Zab-T等一系列型號的龐然大物`。
AutoSpec 6F, AutoSpec-T.Zab-4F, Zab-T雙磁質譜
AutoSpec-Tof：QTof的前身
由于雙磁質譜儀器體積過于龐大和昂貴，如何把這種功能普及是對Micromass研發人員的挑戰。1994年，研發者在AutoSpec磁質譜后串聯了oaTof（正交加速飛行時間質譜），對子離子的分辨率達到2000 FWHM，精度達到50ppm，形成AutoSpec-Tof構型。這樣不但可以同時得到高分辨的子離子和母離子，而且也減小了儀器的體積和價格。這臺AutoSpec-Tof就是QTof的前身。
1994年AutoSpec-Tof和原理圖
從1974到1994年，從磁質譜亞穩離子聯動掃描，到增加CID，串聯四極桿，再演變為雙磁質譜串聯，再到磁質譜-Tof串聯，這就是早期質譜研發者們不斷探索各種串聯質譜的創新史。與此同時，Micromass也一直在研發三重四極桿串聯質譜，第一臺是1984年首次推出的12-250 T，隨后是Trio-3、Quattro系列，一直到今天的Xevo系列。
三重四極桿串聯質譜發展歷程
1996年Q-Tof誕生
在20多年的持續研發后，Micromass在1996年推出了轟動一時的Q-Tof，即由四極桿與Tof串聯構成，四極桿做單位質量分辨的母離子選擇，Tof做子離子精確質量測量。它最大的特點是儀器體積小、性價比高、容易操作。從此Q-Tof進入常規分析時代。
1996年，Waters推出Q-Tof
“這就是Q-Tof的發展歷史，從1974年研發從第一臺磁質譜開始，20多年的時間發展到Q-Tof。這其中探索了很多不同的途徑，最終研發出這款適合普及的儀器。1997年ASMS會上25%的文章都是QTof的應用。 四年之后終于有其它公司跟風生產。因為這款儀器讓很多研究人員獲得了豐碩的研究成果。在去年臺灣舉辦的世界蛋白質組學會上，大會還專門給Q-Tof質譜的設計者頒獎。”舒放說。
從離子隧道到離子淌度的10年
Ion Tunnel離子隧道（用于Q0離子傳輸）
三重四極質譜的離子傳輸（左圖）和CID碰撞室（右圖）示意圖
談起2006年推出的離子淌度質譜SYNAPT HDMS，舒放卻先從三重四極桿質譜說起，傳統三重四極桿的Q1之前的Q0離子傳輸，用的是四極桿。為減少離子傳輸過程中的損失，2001年Micromass研發者設計了環形電場，即在多個環形片上加RF電場。這種環形電場使離子束在傳輸過程中很容易把中性粒子和離子分開，離子能夠有效聚焦和傳輸，氣體則被真空抽掉，這就是當年的離子隧道（Ion Tunnel）。后來改進為ScanWave技術，現在又發展成為StepWave技術，應用于Waters各種質譜。
Ion Tunnel離子隧道和StepWave原理圖
Travelling-Wave行波（簡稱T-Wave，用于碰撞室）
后來研發者發現在加射頻電壓的環形極片上，兩個為一組再加上幾伏的直流電壓DC，電場形成波浪狀，成為T-Wave行波離子傳輸技術，T-Wave構成的多組行波，離子沿軸向運動，直流電壓向前連續切換，如此就可形成一運動的電場或“Travelling Wave”，離子在此電場中做涌浪運動。每一組電壓不僅幫助離子傳輸，還能像海浪一樣推著離子往前走，從而非常精確地控制離子的走向和速度。
將T-Wave應用在碰撞室，極大地提升了串聯質譜的靈敏度。因為母離子CID形成子離子后，由于碰撞氣體的存在會形成離子向后傳輸的阻力。而T-Wave行波技術的出現，離子從漂移變成電場控制運動，可以快速推動離子傳輸到下一級四極桿，有效提升了靈敏度，并降低了交叉污染。
Travelling Wave原理圖
T-Wave用于離子淌度：SYNAPT HDMS誕生
碰撞室的氣壓通常在0.075mpa左右以進行碰撞誘導分解（CID），有意思的是，研發者發現如果氣壓提高（如0.2mpa），還能把離子進一步按照體積和形狀分離開，這就是行波離子淌度技術的雛形。最早見于2004年Micromass研發人員發表的文獻（Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004； 18:2401-2414）。
T-Wave技術隨后被用于Q-Tof質譜，Waters工程師在原有碰撞室氣體的基礎上加了更多的氣體，由于不同尺寸大小的離子碰撞截面積不同，阻力也不同，這樣就能夠把不同形態的離子分開，這項技術即成為如今有名的離子淌度（IMS，Ion mobility separation）技術。小編還追問離子淌度和離子遷移譜的區別。舒放表示，過去的離子遷移譜使用漂移管，飛行過程不但慢，而且擴散嚴重，靈敏度損失很大；而Waters開創的行波離子淌度技術可以精確聚焦和控制離子運行，使用約20cm長的T-Wave，即可獲得2米長漂移管的淌度分辨率。
應用行波離子淌度技術，沃特世在2006年推出高清質譜SYNAPT HDMS（High Definition Mass Spectrometer），并獲得2007年Pittcon金獎。SYNAPT HDMS在質譜分離質量之外，可按照離子的體積、形狀和電荷來分離，增加了分析的特異性和樣品的特征。
2006年Waters推出帶離子淌度的SYNAPT HDMS，獲得2007年Pitton金獎
IMS分辨m/z 545.9499和m/z 545.9502的離子，如果沒有IMS，分開這兩種離子需要180萬的分辨率
SYNAPT沒有止步，它帶來越來越多的驚喜。TriWave是在T-Wave的前邊加一個TRAP，后面加一個TRANSFER，它們均可作為碰撞室；使SYNAPT質譜具備了MS3三級質譜性能。更令人興奮的是，這種三級質譜并不是常見的三級質譜方法：母離子在第一個碰撞室（TRAP）產生的碎片，可在之后的T-Wave淌度分離區中根據形態分離，因此當碎片離子按照形態順序依次進入第二個碰撞室（TRANSFER）后，最終產生的三級碎片不僅包含質量信息，還蘊含了空間結構信息。它被稱為時間排列平行碎裂(TAP，Time Aligned Parallel Fragmentation)的三級質譜技術。Waters后來又相繼推出了SYNAPT G2和SYNAPT G2-S(G2-Si)等SYNAPT系列產品。
Triwave示意圖
在Synapt HDMS上獲得的Verapamil（戊脈安）的三級質譜
實用型離子淌度質譜：Vion IMS QTof
2015年，沃特世推出了Vion IMS QTof。Vion IMS和SYNAPT HDMS的不同在于，Vion將離子淌度放在了離子源和四極桿Q1之間，這是為了更適應MSE全數據采集模式研發的新型離子淌度IMS Q-Tof。
Vion IMS QTof
SYNAPT結構與 Vion結構對比圖
從設計難度上來看，Vion的難度更高。對比SYNAPT與Vion的結構圖可知，不同于SYNAPT儀器內部離子淌度區0.05mbar-0.5mbar的壓差，Vion由離子源區101kbar的大氣壓過渡到離子淌度區內3mbar的高真空，需要很強的真空過渡技術的支持。沃特世為此研發了獨特的真空壓力調節器，它能實時動態調整氣體壓力，保證分析實驗時的壓力與儀器校準時的壓力一致，使離子淌度室內的氣體維持恒定，這就意味著能夠獲得可重復性的CCS測量值，讓離子淌度的數據重復性達到建立日常分析實用的CCS數據庫的標準。現在Vion已經建立了包括了900多個化合物的碰撞截面（CCS）值的數據庫，從而讓IMS技術面向日常分析使用。”舒放表示。
Vion在Q-Tof的Q1前加上IMS分離。由于Q1是僅有單位質量分辨的四極桿，加上IMS后，毫無疑問可以增加MS1對母離子的分離分辨能力。回顧本文前面講到的，這種方法比磁質譜-磁質譜，磁質譜-TOF和QTof要簡單得多；而且非常獨特的是，IMS還可以分辨同分異構體。
同時IMS的有效功能降低了DIA MSE非數據依賴采集方法去卷集數據解析的復雜程度。傳統串聯質譜常用DDA數據依賴采集方法，即第一次先進行全掃描；根據數據強度閾值，第二次選擇第一個母離子CID碎裂；第三次選擇第二個母離子CID碎裂……。在液相色譜峰流出的時間段內，很多時間沒有被充分利用；UPLC的一個色譜峰通常只有2秒，DDA就顯得“力不從心”。Waters發明的DIA MSE非數據依賴采集方法，依靠碰撞室高低電壓的切換，同時獲得母離子和子離子的全部信息，這樣可充分利用幾乎所有時間來進行有效的二級質譜分析而沒有數據丟失。但DIA MSE非數據依賴采集方法也給數據解析帶來了很大難度。在Q1前的IMS可以降低這種后續的數據解析難度，因為IMS在離子進入Q1之前進行了一次有效分離。
離子在IMS中先得到分離（紅色和綠色），分離后的紅色離子進入QTof再進行MS/MS分析
值得一提的是2017年ASMS上Waters還推出了SONAR功能，提高了QTof的MS/MS性能，在UPLC分離的同時通過掃描四極桿電壓使離子分別通過四極桿，再送入碰撞室碎裂。SONAR和IMS是互補的技術，SONAR速度更快；而IMS選擇性更強。它們都可有效降低非數據相關采集（DIA MSE）的數據復雜度，增加定性定量的可信度，并適應UPLC的高速度。
離子（紅色和綠色）通過SONAR在MS1中快速分離后，分別進入CID進行MS/MS分析
“由于離子淌度實現了多一維的正交分離，所以原始數據更加復雜，沃特世還提供強大的組學軟件Progenesis QI，用于代謝組學、蛋白質組學和脂質組學的研究。Progenesis QI兼容性極強，還能夠處理其它非沃特世質譜的數據，該軟件有一半的用戶是其他品牌產品的用戶。為支持Vion、SYNAPT等高分辨質譜的數據分析，沃特世有個很大的計劃，就是把所有的相關軟件都整合到一個平臺，即UNIFI平臺。”舒放說。UNIFI以集成的工作流為中心，能夠實現液相和質譜完美的無縫聯接，并將數據管理納入單一的軟件平臺，該平臺包括數據采集、處理、可視化、報告、配置合理的工具或網絡實驗室環境。
沃特世離子淌度發展史
專注于分離科學 突破無限可能
舒放說：“靜水深流。沃特世專注于分離科學，不斷突破各種分離的極限。液相色譜是根據化合物分子的保留時間分離的，質譜是根據質量電荷比分離，IMS是根據淌度漂移時間分離。沃特世不斷探索，把這三種特性更好地結合起來，突破各種可能。The Science of What’s Possible正是Waters的口號。”沃特世以其悠久的創新歷史和獨特的企業文化，吸引了一批“鐵粉”，“有很多用戶評價沃特世的銷售不像銷售而更像學者，”舒放笑著說，“‘專注’和‘深耕’是沃特世過去、現在和未來都會堅持下去的理念！”
舒放與Brain Green合影
“我今年去英國Waters質譜中心又見到了Brain Green先生，他是VG Micromass公司五個創始人之一，著名的質譜設計專家，曾經獲得英國質譜學會頒發的Aston獎。他雖已年過八十，但依然精神矍鑠，每天為他熱愛的質譜設計事業工作著。老一輩科學家對科研孜孜不倦的精神是我們后來者的楷模”舒放說。
