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液質聯用中的質譜——串聯質譜篇（中）

2023.9.19

　　本文舉幾例常見的串聯質譜儀，篇幅較長分為上、中、下三篇。

　　線性離子阱LIT/FTICR和LIT/Orbitrap

　　QqQ和QTOF都是串聯兩個“離子束”型分析器，近年來還有一種趨勢是串聯兩個離子捕獲型分析器，線性離子阱LIT/FTICR是此類最早的類型，由于維護困難，近年來慢慢被LIT/Orbitrap所取代。離子在不同質量分析器間的傳輸，不是連續的離子束傳輸，而是先在LIT中累積，再以離子包的方式，用C-Trap傳輸到Orbitrap中。實驗中，LIT和Orbitrap可以同時進行質量掃描，提升Duty Cycle和分析效率。

　　Orbitrap相對于FT-ICR的弱點是，Orbitrap在內部無法碎裂離子，無法在Orbitrap分析器中直接進行MSⁿ，而是等待前級傳來的碎片離子MSn，再進行高分辨率分析。但Orbitrap除了維護簡單，還有一些優勢。兩者都是記錄像電流，放大后經FT變換，因此靈敏度與信噪比相近，差異在于分辨率。對于ICR，分辨能力反比于質荷比；對于Orbitrap，分辨能力反比于質荷比的平方根，因此隨著質荷比增加，Orbitrap的分辨能力比ICR下降更為緩和。小于m/z 300，ICR分辨能力高；大于m/z 300，在相同的檢測時間下，ICR分辨能力下降的幅度大于Orbitrap。超過m/z 4000后，ICR的分辨能力降到比Orbitrap更低。因此大分子分析中，Orbitrap更優。

ICR與Orbitrap的分辨能力與質量關系圖。兩種質量分析器分辨能力均隨質荷比增加而下降，而Orbitrap下降的幅度較ICR緩和，在更高質荷比時分辨率優于ICR

　　四極桿/軌道阱（Q/Orbitrap）以及三重串聯質譜儀

　　四極桿和Orbitrap串聯時，主要利用設置于末端的高能碰撞解離（HCD）池執行HCD模式。HCD專指Orbitrap類儀器中離子在高能碰撞池或多級離子通道中的碎裂方式，相比于CID碎裂方式能獲得低m/z的碎片離子，產生的碎片相對更多，譜圖質量更高。Q/Orbitrap的最新型號如Orbitrap Exploris系列，體積緊湊可作為桌上型儀器。

Orbitrap Ascend Tribrid儀器示意圖

　　Orbitrap還可同時結合四極桿和線性離子阱成為三重串聯質譜儀，如最新型號Orbitrap Ascend Tribrid，平臺的三重特性通過多種碎裂技術、多通路性（并行分析，即用一臺分析儀隔離離子，同時用另外兩臺分析儀進行檢測）和同步母離子選擇 (SPS) 實現了功能擴展。這里的C-Trap 有前置多級離子通道，用于離子儲存和MS2碎裂；還有后置多級離子通道。以蛋白質組學定量實驗為例，圖中所示綠、藍、黃色的不同離子正在同步進行不同的運動。綠色離子先被選擇后到Orbitrap后獲得高分辨MS譜，然后經前置多級離子通道HCD碎裂后送入LTQ后續的檢測器獲得MS/MS，又到LTQ獲得MS³，同時累積富集藍色離子；接下來將綠色離子的MS³送入Orbitrap獲得高分辨譜，同時將藍色離子做HCD碎裂，然后重復前面綠色離子的過程。圖中所示，當富集黃色離子時，綠色離子將完成高分辨MS³，藍色離子的MS3正等待送入Orbitrap。

蛋白質組學定量實驗：TMTpro SPS MS³方法

　　Ascend上還具有CID、 ETD, UVPD, PTCR 和MSⁿ

　　HCD 等多種解離模式（后文會專門介紹各種解離模式）。將三個質量分析器協同工作的模式，與不同的解離模式搭配，使Ascend Tribrid具有多種可以操控的組合模式。

　　2023年，賽默飛又推出了新型Orbitrap Astral質譜儀，它也是一個三重串聯質譜儀，包括四極桿、Orbitrap、Astral三個質量分析器。Ascend中，LTQ的譜圖采集速度大概是50Hz，而Astral可以達到200Hz（每秒采集200張MS/MS譜）；同時Astral可以獲得8萬分辨率的MS/MS譜，只是Astral無法如LTQ再進行MS³實驗。未來，三個質量分析器還可以通過協同工作，產生更多的實驗流程。

Orbitrap Astral示意圖

　　離子淌度質譜

　　離子淌度（Ion Mobility）有時譯為離子遷移，出現早期也被稱氣相電泳，可以獨立使用，也可以配合質譜使用。最早的研究始于1950s，因其結構簡單、快速、靈敏、小巧便攜適于揮發物檢測，在安檢、化學武器、爆炸物與毒品檢測、在線檢測等領域，可獨立使用，原理與TOF類似，但不需要高真空。離子淌度的核心原理是電場驅動下離子在氣體阻尼環境中的遷移速率產生差異而分離。本文只介紹同質譜配合使用的離子淌度。

　　一種應用是安裝在質譜儀的離子源與真空接口之間，使用氣相差分離子淌度來分離共洗脫化合物、同分異構化合物以及隱藏在高背景噪聲中的化合物。其代表是SCIEX的SelexION技術和賽默飛的FAIMS技術。

　　SCIEX的離子淌度差分質譜分離技術(Differential Mobility Spectrometry, DMS) 又叫差分離子淌度。SelexION DMS裝置由兩塊平行金屬電極（10×30mm，1mm間隔）構成，置于curtain （離子源簾氣）和 orifice（采樣錐）之間，在大氣壓條件下工作，結構簡單耐用，拆裝無需破壞質譜真空系統。分離電壓 (SV) 垂直于輸送氣流的方向應用至整個離子傳輸通道，由于高電場和低電場離子淌度系數之間的差異，離子向壁遷移并離開飛行路徑。它們的軌跡通過稱為補償電壓 (COV) 的平衡 DC 電壓校正。DMS 技術記錄在一定范圍的 SV 振幅下校正特定離子的軌跡所需的 COV。可以掃描 COV 以根據離子的差分淌度連續傳遞離子，或者將其設置為固定值以僅傳遞具有特定差分淌度的離子種類。

SelexION工作原理示意圖

　　DMS通過降低化學噪聲及預分離相似質量的離子，提高質量分析的質量和定量準確性。在 SV 和 COV 設置為零時允許無差別傳輸所有離子。DMS支持同時傳輸兩種極性的離子，并根據它們的差分淌度常數分別進行分離。

　　FAIMS（High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry，高場非對稱波形離子遷移譜）和SelexION類似，只是兩電極由內部圓柱電極、外部環電極組成，離子在電場的驅動下繞過中心圓柱電極。工作時，離子在氣流的攜帶下移動，在兩電極上加上兩組電壓：周期不對稱方波 DV 和補償電壓 CV。DV 是周期性的高/低電壓交替。由于高/低電壓所對應的遷移率不同，離子會呈現鋸齒狀軌跡，且每個周期都會有一小段垂直方向上的位移。在此基礎之上，若疊加固定的補償電壓CV，則滿足特定差分遷移率（高場下遷移率與低場下遷移率的差值，因此 FAIMS 也叫差分離子淌度）的離子能夠平穩地飛過電場，其它離子則會撞到極板上，這就實現了離子選擇。若隨時間改變CV即可實現對不同離子的掃描，電壓范圍一般為-50V~10V。

賽默飛FAIMS Pro Duo高場非對稱波形離子遷移譜

　　離子淌度的另一種應用是在質譜內部，強調為傳統質譜增加新的分離維度，提升信噪比，并可分辨同分異構體、多電荷態。離子淌度質譜自Waters 2006年推出SYNAPT 開始，在很多高端QTOF質譜中配置，如安捷倫于2009年推出6540，布魯克于2016年推出timsTOF。離子淌度裝置的位置在離子傳輸Q0區或碰撞室Q2區，淌度分離是第一目標，后來從timsTOF開始發現有富集離子的作用，在和TOF的脈沖配合后有提升Duty Cycle的作用，即在TOF脈沖進樣的間隔富集離子，在進樣時把所有的離子送入TOF。由于四極桿Q1是連續流傳輸離子的，所以淌度裝置在Q1前端Q0區和Q1后端Q2區都能發揮同樣的作用（當然，如果不用淌度裝置，用阱類裝置也可以達到富集離子，提升Duty Cycle的效果）。

　　離子淌度使傳統質譜除了按質量和電荷數之外，還可以根據離子的尺寸和形狀分析樣品，為研究人員提供了傳統質譜所不能獲取的特異性信息。該技術所獲取的4維數據信息，包括色譜保留時間、質譜質荷比、淌度漂移時間、離子強度。通過軟件能夠對其中的任意二維或三維信息進行自由選取或可視化處理。

安捷倫6560離子淌度QTOF示意圖

　　安捷倫2021年最新的6560C離子淌度QTOF的工作原理為：入口離子漏斗聚焦，進入捕集漏斗，累積一定量離子后，打開ion gate，向漂移管（約80cm長）注入離子。離子依次通過漂移管，進入出口離子漏斗，再次聚焦，進入后級Q1四極桿。使用安捷倫高分辨率多重性分解 (HRdm 2.0) 軟件進行后處理，可實現高達 200 的全譜離子淌度分辨率。

　　沃特世有獨特的各種“Wave“技術，用于Q0和碰撞室，如ScanWave，StepWave，Travelling-Wave行波（簡稱T-Wave）技術等，主要是為了提升傳輸效率。T-Wave技術用于QTOF碰撞室，在原有碰撞室氣體的基礎上加更多的氣體，由于不同尺寸大小的離子碰撞截面積不同，阻力也不同，因此能把不同形態的離子分開，即離子淌度。沃特世在2006年推出高清質譜SYNAPT HDMS，目前最新型號為SYNAPT XS。

沃特世SYNAPT系列離子淌度QTOF示意圖

　　首先離子在TRAP T-Wave中蓄積，然后被釋放到IMS T-Wave中，完成離子分離。隨后離子通過TRANSFER T-Wave 傳輸至質量分析器。其工作周期約幾十毫秒。注意，IMS離子淌度分離發生在Q1后的碰撞池中。2015年，沃特世還推出了VION，和6560類似，淌度池在離子源和Q1之間的Q0區。

　　2019年沃特世發布了環形淌度 SELECT SERIES Cyclic IMS ，用緊湊型環形離子導向裝置替代傳統的線性離子淌度區域，可以控制離子進行一圈或多圈的淌度分離，淌度分辨率可從單圈的65提升到多圈的400，甚至有研究報道至100圈時可獲得750的淌度分辨率。鍍金電極陣列固定于PCB板上，多功能T-WAVE 陣列控制離子多種模式，除了可以根據選擇做多圈的淌度分離后送入TOF，還可以從離子組合中選擇并分離出某個離子，并以CID活化重新注入，進而可獲得IMSn（n最多為5級）。

沃特世SELECT SERIES Cyclic IMS環形淌度質譜儀示意圖

　　2016年，Bruker推出timsTOF，淌度分辨率從原來市場上的40 提升到近200，關鍵技術是TIMS (Trapped Ion Mobility Spectrometry) 捕集離子淌度，其位置在Q1前。

TIMS原理示意圖

　　氣流攜帶離子進入逆向梯度電場（像一個加了坡度的跑步機），若氣流速度與離子的遷移速率相等則離子相對于漂移管靜止，即不同離子依其淌度差異，分布在不同電場強度的位置。離子截面越大，離子淌度越小，維持靜止所需的電場強度越高，即穩定在高場區域。此時若逐漸降低電壓，即實現掃描。若改變電場梯度分布還可選擇性釋放出單一淌度值的離子，即SA-TIMS (selected accumulation-TIMS)。其工作氣壓約0.2 ~ 0.5 KPa。傳統的2米長的遷移管，分辨率約等于80左右；而只需要一個5厘米長的TIMS部件，由于流速可調，將流速增加至漂移距離約等于10米，R即可約等于180。

　　隨后，布魯克推出了雙TIMS的timsTOF Pro和隨后的系列，并和Matthias Mann合作發布Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) 平行累積連續碎裂技術。它使用了兩組 TIMS，離子在第一個TIMS部分中進行累積，然后進入第二個TIMS完成淌度分離，分離后的離子繼續MS/MS碎裂，隨后重復該步驟。而在PASEF過程中，當第二個TIMS進行分離時，第一個TIMS也同時在平行地累積離子，這樣可以實現近乎100％的離子利用率。對于蛋白質組學來說，大幅提升靈敏度和序列覆蓋率；同時結合了離子淌度的4D分離技術，能夠實現碰撞橫截面（ CCS ）的分析，也在蛋白質組學的相關應用中發揮了巨大作用。