通過CsCl 等密度梯度離心純化λ噬菌體顆粒實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理 CsCl 等密度梯度離心用于制備最高純度的感染性 λ 噬菌體顆粒，它沒有任何細(xì)菌核酸的污染。從這種噬菌體顆粒中提取的 DNA 可用作 DNA 測(cè)序的模板、亞克隆至質(zhì)粒載體和產(chǎn)生用于原位雜交的探針。這種方法第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，由它所獲得的噬菌體原種是高度濃縮的（大于 1011 cfu/ml)，在 4℃ 保存時(shí)，許多年后仍能保持它們的感染力。
實(shí)驗(yàn)材料 λ 噬菌體懸浮液
試劑、試劑盒 CsCl乙醇
儀器、耗材 Beckman SW41 或 SW28 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號(hào)Beckman Ti50 或 SW50.1 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號(hào)皮下注射用針頭
實(shí)驗(yàn)步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) CsCl（固體）
(2) CsCl 溶液
(3) 乙醇
2. 離心機(jī)和轉(zhuǎn)子
(1) Beckman SW41 或 SW28 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號(hào)
(2) Beckman Ti50 或 SW50.1 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號(hào)，配有清亮的離心管（如 Beckman 超亮離心管）
3. 專用設(shè)備
皮下注射用針頭（21號(hào)）
4. 載體和菌株
λ 噬菌體懸浮液
二、方法
1. 測(cè)定噬菌體懸浮液的體積，每毫升加入 0.5 g 固體 CsCl，攪拌混勻使其完全溶解。
2. 倒入足夠量的 CsCl 分級(jí)梯度，使噬菌體懸浮液分成幾個(gè)組分，每個(gè)梯度能容納約 16 ml 噬菌體懸浮液。所需分級(jí)梯度的量等于親水相的最終體積（步驟1），親水相又被分成數(shù)份，每份為 0.4 X 離心管體積。用適合于 Beckman SW41 或 SW28 轉(zhuǎn)子（或相當(dāng)型號(hào)）的清亮塑料離心管（如 Beckman 超亮離心管)。
3. 在 ρ=1.50 g/ml 和 ρ=1.45 g/ml 兩層界面的相應(yīng)試管壁外側(cè)，用永久性標(biāo)簽筆作上標(biāo)記。
CsCl 分級(jí)梯度大約占超離管體積的 60%。比如，對(duì)一個(gè)能裝 38 ml 的 Beckman SW28 試管（或相當(dāng)型號(hào)），分級(jí)梯度由三種均為 7.6 ml 的 CsCl 溶液組成。平衡管裝有同樣密度的 CsCl 溶液。
4. 小心地將噬菌體懸浮液加至分級(jí)梯度上，4℃，87000 g ( 22000 r/min 于 Beckman SW28 轉(zhuǎn)子中）離心 2 h。
5. 按下面的方法對(duì)離心管進(jìn)行穿孔，以收集噬菌體顆粒。
(1) 用酒精仔細(xì)地擦去離心管外的油污，然后在離心管的外側(cè)貼上 Scotch 膠帶，與噬菌體顆粒帶平齊。
膠帶起到封條的作用，防止針頭四周滲漏。
(2) 用 21 號(hào)皮下注射用針頭（不需要注射針筒）穿過膠帶刺入離心管，收集噬菌體顆粒帶。
手指遠(yuǎn)離針頭刺入方向，以免剌穿離心管。注意不要使梯度中其他帶內(nèi)物質(zhì)污染噬菌體顆粒。這些帶內(nèi)含有細(xì)胞碎片和未裝配的噬菌體成分。
6. 將噬菌體顆粒懸浮液裝入適宜于 Beckman Ti50 或 SW50.1 轉(zhuǎn)子（或相當(dāng)型號(hào)）的超離管中，加入 CsCl 溶液（ρ=1.5 g/ml 于 SM 中)。4℃，150000 g ( 41000 r/min 于 Beckman Ti50 轉(zhuǎn)子中）離心 24 h 或 160000 g ( 36000 r/min 于 Beckman SW50.1 轉(zhuǎn) 子中）離心 24 h。
7. 如步驟 5 所述收集噬菌體顆粒帶，于 CsCl 溶液中 4℃ 密封保存于一試管中。
8. ( 可供選擇）如果必要，噬菌體顆?？赏ㄟ^新一輪的 CsCl 平衡梯度離心進(jìn)一步純化和濃縮。將噬菌體懸浮液轉(zhuǎn)移至適宜于 Beckman SW50.1 轉(zhuǎn)子（或相當(dāng)型號(hào)）的一個(gè)或多個(gè)超離管中，加入 CsCl 溶液（ρ=1.5 g/ml 于 SM 中），160000 g ( 36000 r/min 于 Becrkman SW50.1 轉(zhuǎn)子中）4℃ 離心 24 h。當(dāng)離心完成后，如下面“替代方案”的步驟 3 和 4 所述收集噬菌體顆粒。
