熒光定量PCR vs. 恒溫擴增，誰才是分子診斷的未來？
熒光定量PCR 和恒溫擴增在分子診斷方面的應用日漸受關注，兩種技術孰優孰劣，且聽作者娓娓道來。
基于核酸擴增的分子診斷，是通過引物介導特異性擴增目的基因，以檢測內源性（遺傳或變異）或外源性（病原體）目的基因的存在與否，從而對疾病的診斷和治療提供信息和決策依據。
其主要應用場景有傳染病的診斷，血篩，腫瘤早期輔助診斷，腫瘤的分子分型，遺傳病的診斷，產前診斷，組織分型等。其中在傳染病的診斷和血篩方面，基于核酸擴增的分子診斷能縮短診斷的“窗口期”，并且可以定量對病原體進行檢測。相比于傳統的免疫診斷方式而言，有不可替代的優勢。
一方面，由于PCR技術的不斷成熟，特別是實時熒光定量PCR (qPCR)的出現，使得基于qPCR的分子診斷產品日漸成為主流。
這一塊有幾個明星產品：賽沛（Cepheid）的GeneXpert PCR分析儀，BioFire的ilmArray，IQuum的cobas Liat PCR System 以及Atlas Genetics的io。這幾個明星產品的孵化公司大多被巨頭收購。
賽沛在2016年9月被丹納赫以40億美元收購；
BioFire在2013年9月被生物梅里埃宣布以4.5億美元收購；
IQuum 在2014年4月被羅氏以4.5億美元收購；
英國Atlas Genetics，萬孚生物在2016年以約1.25億人民幣獲得其14.95%的股權。
競爭激烈和受歡迎程度由此可見一斑。這幾款產品均基于微流控的分子診斷產品。另外，我國的博暉創新也于2017年發布了一款基于PCR微流控技術的全自動核酸檢測系統。
圖1. BioFire的filmArray
另一方面，環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是Notomi等在1998年報道的一種等溫核酸擴增技術。
該法依賴于識別保守序列DNA的6個特異性片段的4條引物（2條外引物和2條內引物）和一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）。LAMP檢測體系中基因的擴增和產物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在30～60min擴增 109?~1010?倍，特異性較高。
LAMP技術的主要原理是DNA在65℃左右可以處于動態平衡狀態，DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環。基于這一技術的產品包括美艾利爾 i 分子診斷平臺，博奧生物的晶芯RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀，百康芯的iChip-400。
圖2. 博奧生物的晶芯RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀
本文將重點比較分子診斷中競爭較為激烈的LAMP和實時熒光定量PCR(qPCR)兩種技術的優劣。
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儀器成本
LAMP只要一個溫度（65度左右），相對于qPCR的三個溫度的循環，基于LAMP的擴增儀器的溫控更容易實現。所以基于LAMP的儀器更簡單更便宜，加熱耗能更少。
但是另一方面來看，LAMP的引物設計難度高，試劑成本也相應高于qPCR。
圖3. qPCR技術需要三個溫度的循環
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擴增速度
同樣由于LAMP只要一個溫度（65度左右），相對于qPCR的三個溫度的循環，LAMP擴增不需要反復的升溫降溫過程，所以基于LAMP的擴增速度快于qPCR的擴增速度。LAMP一般可在30～60min擴增 109~1010?倍，而qPCR的擴增速度往往取決于擴增儀器加熱和冷卻的速率。
由于LAMP可以短時間內獲得大量的DNA產物，所以可以實現基于濁度的可視化檢測。從這個角度上講，LAMP尤其適用于定性的POCT。
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擴增特異性
由于LAMP技術一般需要相對較長6個引物，而qPCR只用2個引物，在核酸擴增中只有所有的引物序列都匹配才擴增，所以基于LAMP的核算擴增特異性更強。也就是說，同樣條件下LAMP的誤擴增的概率更低。
圖4. LAMP擴增一般需要6個引物
這一方面，筆者并沒有找到有效的數據證據。因為擴增的特異性與引物的設計息息相關，所以并不能簡單的比較兩個技術的擴增的特異性。基于兩對引物的巢氏PCR的出現也大大的增強了qPCR特異性，這里最典型的應用實例就是filmArray。
圖5. 使用兩對引物的巢氏PCR技術進一步提高了擴增的特異性
4
檢測的靈敏度
案例1:
Zhibing Lin等人的研究表明使用LAMP和qPCR（real-time PCR）分子診斷技術對于弓形蟲DNA的檢測極限分別是10fg/ul和1fg/ul。常規PCR，LAMP，qPCR檢測284只豬和292羊對應檢測出的弓形蟲陽性比例為：0.4%，3.2%，4.2%和 3.8%，17.1%，17.8% [1]。
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案例2:
Guangxiang Wang等人的研究表明在羊的口瘡病毒檢測中，LAMP正確識別出46只陽性中的41只（89.13%）; qPCR (real-time PCR)正確識別出了46只陽性中的42只(91.30%) [2]。
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案例3：
Yi Tang等人的研究表明在坦布蘇病毒的檢測中，qPCR和LAMP的DNA檢測極限分別為：2copies/ul和20copies/ul；RNA檢測極限分別為10fg/tube和100fg/tube。檢測出來的概率：qPCR和LAMP：82.6%和79.7% [3]。
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案例4：
Chapey E.等人的研究表明，在臨床弓形蟲檢測中，有一個病例qPCR檢測出來了，LAMP沒有檢測出來；LAMP檢測出來的qPCR均能檢測出來；LAMP還有兩個病例不確定，qPCR并沒有 [4]。
圖6. LAMP和qPCR在臨床弓形蟲檢測中的結果對比
總結：以上四組案例均表明，qPCR的檢測靈敏度高于LAMP。也就意味著，同樣的條件下，qPCR檢測的假陰性概率低于LAMP。
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對抑制劑的敏感性
LAMP對樣品中抑制劑敏感性低于qPCR，這也就意味著LAMP對擴增環境的要求低于qPCR。
6
通量
眾多周知，在實際的產業化中，分子診斷儀器的通量往往至關重要。對于qPCR而言，由于引物設計的成熟和熒光通道的多樣性，往往可以比較好的實現高通量檢測。我們所熟知的基于多重PCR的filmArray最高一次可以并行檢測二十幾個指標。
另一方面，由于LAMP的引物需要4-6個（qPCR兩個）且LAMP引物一般較長，LAMP的引物設計難于qPCR（雖然有LAMP引物檢索網站的協助，但這個問題依然存在）。引物設計困難也導至了LAMP的檢測通量受限。
結語：
LAMP雖然很好的解決了PCR的溫控難題，但是也相應帶來了其他的問題，比如相對于qPCR而言，檢測靈敏度不夠，引物設計更困難等。這里面最大的問題還是相對于PCR很成熟的技術體系而言，LAMP目前還需要不斷的優化和發展。我們也期待著LAMP技術的成長，從而為分子診斷帶來更好的產品。
參考文獻：
1.??Lin Z, Zhang Y, Zhang H, et al. Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis[J]. Veterinary parasitology, 2012, 185(2): 296-300.
2.??Wang G, Shang Y, Wang Y, et al. Comparison of a loop-mediated isothermal amplification for orf virus withquantitative real-time PCR[J]. Virology journal, 2013, 10(1): 138.
3.??Tang Y, Yeh Y T, Chen H, et al. Comparison of four molecular assays for the detection of Tembusu virus[J]. Avian Pathology, 2015, 44(5): 379-385.
4.??Chapey E. et al. An evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detected Toxoplasma gondii in clinical specimens.
