人外周血B、T淋巴細胞的分離方法
目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞。
方法:
1. 在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2. 取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3. 離心后管內分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶(如下圖)，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。
單個核細胞濃度(細胞數／1毫升細胞懸液)＝
4個大方格內細胞總數
────────── × 104×2(稀釋倍數)
4
6. 細胞活力檢測：死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。
活細胞數
活細胞百分率＝────── ×100％
總細胞數
用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上。
推薦
-
科技前沿
