小環(huán)狀干擾 RNA (sciRNA) 作為基因沉默的有效治療平臺
為了實(shí)現(xiàn)由RNA干擾(RNAi)途徑介導(dǎo)的有效的治療性基因沉默，小干擾RNA (sirna)必須經(jīng)過化學(xué)修飾。一些具有在代謝上穩(wěn)定sirna潛力的超rna結(jié)構(gòu)已被評估其誘導(dǎo)基因沉默的能力，但所有這些結(jié)構(gòu)都有局限性或尚未在治療相關(guān)的背景下進(jìn)行探索。共價(jià)閉合環(huán)狀RNA轉(zhuǎn)錄本普遍存在于真核生物中，有潛力作為生物標(biāo)志物和疾病靶點(diǎn)，環(huán)狀RNA模擬正在被探索用于治療。
本文報(bào)道了小環(huán)狀干擾rna (sciRNAs)的合成和評價(jià)。為了合成scirna，將三價(jià)n -乙酰半乳糖胺(GalNAc)配體功能化并經(jīng)click化學(xué)環(huán)化的sense鏈退火成反義鏈。這一策略用于small circles的合成，但也可以用于合成更大的環(huán)狀RNA模擬物。作者在體內(nèi)和體外評估了各種sciRNA設(shè)計(jì)。作者觀察到在循環(huán)和脫靶效應(yīng)被消除后，感覺鏈的代謝穩(wěn)定性得到了改善。反義鏈的5 -(E)-乙烯基膦酸酯修飾導(dǎo)致galna ?-scirna在治療相關(guān)劑量的體內(nèi)有效。物理化學(xué)研究和基于核磁共振的結(jié)構(gòu)分析，以及分子建模研究，闡明了這類具有部分雙工特征的新型sirna與RNAi機(jī)制的相互作用。
環(huán)狀rna (circrna)是共價(jià)封閉的轉(zhuǎn)錄本，人們現(xiàn)在知道它在真核生物中高度流行和保守。病毒還編碼環(huán)狀rna，這些環(huán)狀rna似乎參與了疾病的發(fā)病機(jī)制。在真核生物中，環(huán)狀RNA是通過線性RNA轉(zhuǎn)錄本的反向剪接形成的。盡管這些環(huán)狀分子在40年前就被發(fā)現(xiàn)了，但它們在很大程度上直到最近才被忽視。現(xiàn)在有令人信服的證據(jù)表明環(huán)狀rna不僅僅是剪接過程的副產(chǎn)物。
某些環(huán)狀rna明顯具有調(diào)節(jié)功能。例如，環(huán)狀rna引發(fā)了導(dǎo)致巨噬細(xì)胞激活的級聯(lián)反應(yīng)。一些環(huán)狀RNA與mRNA或microRNA結(jié)合，一些參與RNA結(jié)合蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸，一些起隔離蛋白的作用。circRNA的失調(diào)與癌癥的發(fā)展有關(guān)，它們在體液中的穩(wěn)定性使這些circRNA成為有前途的生物標(biāo)志物。circAGO2就是一個(gè)例子。這種環(huán)狀rna在各種腫瘤中檢測到高水平，在動物模型中促進(jìn)腫瘤生長，并與患者預(yù)后不良有關(guān)。此外，circrna在大腦中含量豐富，與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。
由于這些功能，合成環(huán)狀rna作為潛在藥物、疾病的生物標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)和研究工具有相當(dāng)大的興趣。一種與miR-21互補(bǔ)的多區(qū)域合成環(huán)狀rna可抑制癌細(xì)胞的增殖，支持在治療中使用環(huán)狀rna。環(huán)狀rna可以通過體外轉(zhuǎn)錄制備，然后通過夾板結(jié)扎將分子環(huán)化，就像制備miRNA海綿一樣。由于難以產(chǎn)生大量的環(huán)狀rna，合成環(huán)狀rna的潛在用途受到限制。
RNA圈的另一個(gè)潛在應(yīng)用是RNA干擾(RNAi)領(lǐng)域。2021年,15年之后安德魯火和克雷格·梅洛被授予2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎的RNAi途徑的發(fā)現(xiàn),四個(gè)小干擾rna (siRNAs)現(xiàn)在批準(zhǔn)臨床使用,和大量臨床實(shí)驗(yàn)的RNAi療法正在通過人體臨床試驗(yàn)。目前的臨床開發(fā)途徑主要是與三價(jià) N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 配體結(jié)合的 siRNA，這導(dǎo)致靶向遞送至肝細(xì)胞。三種獲批的 GalNAc-siRNA 偶聯(lián)物均使用 2-deoxy-2-fluoro (2-F) 和 2-O-methyl (2-OMe) 進(jìn)行全面修飾，并使用硫代磷酸酯 (PS) 進(jìn)行戰(zhàn)略性修飾以賦予穩(wěn)定性。
與GalNAc結(jié)合的sirna的堿基、核糖糖和磷酸主鏈的化學(xué)修飾對于賦予有利的藥理特性是必要的，并且已經(jīng)評估了大量的化學(xué)修飾。sirna三維結(jié)構(gòu)水平的改變也被探索。評估的超rna結(jié)構(gòu)包括發(fā)夾siRNA、啞鈴狀納米環(huán)狀siRNA、siRNA納米片、分支siRNA、用于基因表達(dá)的籠型環(huán)狀siRNA、作為siRNA前體的環(huán)狀單鏈rna以及脫靶效應(yīng)降低的環(huán)狀siRNA。
然而，評估這些結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)往往沒有利用治療相關(guān)的siRNA化學(xué)修飾或?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)，或者，在共價(jià)環(huán)化的情況下，采用低效的策略，如肽偶聯(lián)或T4連接技術(shù)。環(huán)狀siRNA設(shè)計(jì)的好處，正如前面其他人所描述的，減少了意義鏈的脫靶效應(yīng)，由于增強(qiáng)了核酸酶抗性而延長了持續(xù)時(shí)間，以及保留效力。在描述環(huán)狀 siRNA 體內(nèi)分析的早期報(bào)告中，它們以高劑量局部給藥，未評估內(nèi)源性基因沉默。在最近對小鼠前藥型共價(jià)閉合 siRNA 的評估中，與非環(huán)狀 siRNA 相比，全身給藥可延長循環(huán)并改善肝臟、腎臟和肌肉中的基因沉默活性；然而，所使用的劑量(20mg /kg, q3 d 3)在治療上是不現(xiàn)實(shí)的。
sciRNA:Ago2 復(fù)合物的模型表明可以容納環(huán)狀有義鏈
在這里，作者在體內(nèi)和體外評估了sciRNA的效力。此外，作者還對肝臟和肝臟提取物中sciRNAs的代謝穩(wěn)定性進(jìn)行了表征，并確定了反義鏈在小鼠皮下給藥后與Argonaute 2 (Ago2)結(jié)合的能力。基于物理化學(xué)和 NMR 的結(jié)構(gòu)分析和分子建模研究揭示了具有部分雙鏈特征的 sciRNA 與 RNAi 機(jī)制的相互作用。在的研究證實(shí)，sciRNAs在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)沉默的效果與臨床使用的sirna相當(dāng)。作者所了解到的關(guān)于sciRNAs的合成、化學(xué)修飾和物理特性將適用于其他新型環(huán)狀rna。
