RNA介導(dǎo)的基因沉默實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)材料 pGEM-T 載體DNA 模板
試劑、試劑盒 dNTP 混合物DNA 聚合酶（Sigma) 及配套緩沖液限制酶
儀器、耗材 PCR 純化試劑盒或柱子
實(shí)驗(yàn)步驟
一、篩選目的基因片段的參數(shù)
1. 序列
( 1 ) 構(gòu)建一個(gè)指定的 RNA 沉默載體首先要進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)目的基因?qū)?yīng)的已知 cDNA 序列或預(yù)測(cè)的基因序列設(shè)計(jì)引物，用反轉(zhuǎn)錄-PCR ( RT- PCR) 方法擴(kuò)增 cDNA 上的一部分序列。如果沒(méi)有目的基因的基因組序列，可以用其他物種中基因的序列去搜索已知序列的 cDNA。如果目的基因是多基因家族的成員，就需要與家族成員進(jìn)行多重比較以指導(dǎo) PCR 引物的設(shè)計(jì)。要擴(kuò)增的基因區(qū)域以及它與其他基因的相似性決定了該 RNAi 載體靶向單個(gè) mRNA 還是多個(gè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
( 2 ) 擴(kuò)增編碼區(qū)和非編碼區(qū)（UTR ) 都能獲得好的沉默效果。由于沉默機(jī)制依靠序列同源性，因此相關(guān)的 mRNA 序列有可能被交叉沉默。如果沒(méi)有特殊要求，應(yīng)選擇與其他序列同源性較低的序列，如 5' 或 3' UTR。為減少交叉沉默，應(yīng)避免選擇與目的基因以外的序列有大于 20 個(gè)堿基一致性的區(qū)段構(gòu)建載體。
( 3 ) 目前已經(jīng)有標(biāo)準(zhǔn)的軟件能幫助檢測(cè)序列同源性，以精確、系統(tǒng)地評(píng)估并最大限度地減少 siRNA 序列和目的基因之間 RNAi 脫靶情況的發(fā)生[ 45 ] (見(jiàn)注6 ) 。
( 4 ) 除了基因的編碼區(qū)以外，截短的啟動(dòng)子表達(dá)的 dsRNA 也能誘導(dǎo)基因抑制。這種方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默（TGS) ?[46, ?47]。
2. 大小
范圍在 50~1000 bp 之內(nèi)的基因片段已經(jīng)被成功地用作基因沉默的靶標(biāo)。正確選擇片段長(zhǎng)度時(shí)需要考慮兩個(gè)因素：片段越短，則沉默的頻度越低； 發(fā)夾越長(zhǎng)，在細(xì)菌寄主中發(fā)生重組的概率越大。為了達(dá)到最優(yōu)化的沉默效率，我們推薦使用 300~600 bp 片段長(zhǎng)度。
二、RNAi
發(fā)夾 RNA 載體（hpRNA ) 的產(chǎn)生
構(gòu)建 hpRNA 的方法有多種?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)的植物轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行構(gòu)建，這種方法需要將每個(gè)目的基因?qū)?yīng)的發(fā)夾編碼結(jié)構(gòu)都重新構(gòu)建到載體上。另外，可以使用通用的基因沉默載體，如由 CSIRO ( 澳大利亞）開(kāi)發(fā)的用于谷物轉(zhuǎn)化的 pStarling 和 pStargate 系列載體（http ://www . pi. csiro. au/RNAi/vectors.htm ) 。只需要通過(guò)傳統(tǒng)的克隆 ( pStarling) 方法或使用 Gateway定向重組系統(tǒng)（pStargate) 將目的基因的 PCR 衍生物克隆到上述載體即可。
1. 克隆與目的 mRNA 同源的 cDNA 片段
( 1 ) RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中使用的引物需要添加 BamH I 和 Bgl Ⅱ 限制酶酶切位點(diǎn)，用來(lái)擴(kuò)增與目的基因序列一致的、300~600 bp 的片段。BamH I 和 Bgl Ⅱ 作為同尾酶，二者酶切產(chǎn)生的片段末端彼此兼容。該操作保證基因片段能被有方向性地克隆到 PAHC7 載體唯一的 BamH l 位點(diǎn) [17]。
( 2 ) 內(nèi)含子片段的克隆策略與上述目的基因的克隆策略相同。
( 3 ) PCR 擴(kuò)增所采用的程序：94°C 變性 45 s、62°C 退火 45 s、72°C 延伸 90 min，共擴(kuò)增 35 個(gè)循環(huán)。
( 4 ) 以 cDNA 片段為模板擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)如 BamH I 和 Bgl Ⅱ 酶切后被克隆到 PAHC17 質(zhì)粒的及 BamH I 特異性限制位點(diǎn)（見(jiàn)注 7 和圖 12. 3) 。
( 5 ) 反向重復(fù)序列組裝完成后即可克隆到合適的雙元載體上，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。
2. pSTARLING 載體
( 1 ) 如果將多個(gè)目的基因逐一進(jìn)行沉默將是一件很費(fèi)力的工作。研究發(fā)現(xiàn) pSTAR-LING 系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率非常高，并且適用于同時(shí)沉默少量幾個(gè)基因。
( 2 ) 該載體采用玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)發(fā)夾 RNAi 產(chǎn)物在單子葉植物中高水平地組成性表達(dá)。
( 3 ) 用傳統(tǒng)的限制酶酶切和 DNA 連接技術(shù)可將 PCR 片段插入到載體上，反向片段插入到 BamH I Pad I Asc I 多克隆位點(diǎn)，正向片段插入到 SpeI SnaBI KpnI 多克隆位點(diǎn)。
3. pSTARGATE 載體
( 1 ) 該載體可以作為另外一種高通量載體 pSTARLING 的替代產(chǎn)品，采用了商品化可用的 Gateway 克隆系統(tǒng)（http : // www . Invitrogen . com ) , 能沉默大量的基因（如一個(gè)基因家族成員或一個(gè)通路的成員）。
( 2 ) 該載體也能實(shí)現(xiàn)方向性克隆。該體系含有的陰性選擇標(biāo)記（ccdB）能篩選掉無(wú)重組反應(yīng)的載體，并高效地獲得重組質(zhì)粒。
( 3 ) pSTARGATE 載體包含兩個(gè)重組盒，在反向重復(fù)鏡像中包含 attP1-ccdB-attP2 或 attR1-ccdB-attR2，因此當(dāng)基因片段側(cè)翼含有合適的 att 位點(diǎn)時(shí)能與載體發(fā)成重組產(chǎn)生 ihpRNA 編碼的結(jié)構(gòu)。
4. 構(gòu)建的質(zhì)粒載體的鑒定
( 1 ) 將擴(kuò)增的所有 cDNA 片段亞克隆到 pGEM-T 載體。
( 2 ) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli，并篩選具有氨芐抗性的克隆，用少量細(xì)菌培養(yǎng)液提取質(zhì)粒 DNA，用限制酶酶切圖譜鑒定重組質(zhì)粒。
( 3 ) 為確定克隆的 DNA 片段正確，每一個(gè)最終的載體都需要進(jìn)行 DNA 測(cè)序。因?yàn)樵诖蠊こ讨写嬖谝粋€(gè)潛在的問(wèn)題，即大量 cDNA 片段可能被平行克隆并且發(fā)生混合。
( 4 ) 每個(gè)構(gòu)建均要進(jìn)行完整的反向序列片段測(cè)序，并將產(chǎn)生的序列和目的基因序列比對(duì)之后才能最終確定。
5. 沉默表型的檢測(cè)
( 1 ) 不同的 hpRNA 轉(zhuǎn)基因株系因?yàn)楦蓴_效果的不同會(huì)產(chǎn)生一系列程度不同的缺陷表型 [22 , 48 ]。
( 2 ) 由于 RNAi 干擾效果有很大的不同（微弱、中等、強(qiáng)），靶 mRNA 的水平變化可以從與野生型一致到完全檢測(cè)不到（見(jiàn)注 8) 。
三、VIGS
?1. VIGS 接種技術(shù)
( 1 ) BSMV 基因組中每一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（野生型的或經(jīng)過(guò)遺傳改造的）以 1 : 1 : 1 比例混合，并加入接種緩沖液 FES [49]。
( 2 ) 將混合物摩擦接種于生長(zhǎng) 7 天的植物。戴上手套后，吸取混合物放置于并攏的拇指和食指中間。
( 3 ) 用另一只手握住植物的基部，用戴手套的食指和拇指輕輕擠壓第一葉和第二葉。
( 4 ) 并攏的手指輕輕地從基部到尖部滑動(dòng)兩次之后，整個(gè)葉片表面均涂滿混合物。
2. 用 BSMV 沉默內(nèi)源的大麥或小麥/基因
( 1 ) 將野生型 BSMV 質(zhì)粒、βRNA 質(zhì)粒、不攜帶植物序列的（BSMV: ?00 ) 或含有片段的 γRNA 衍生物質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以 1:1:1 比例混合接種于溫室生長(zhǎng)的大麥和小麥幼苗。
( 2 ) 用 BSMV- PDS 摩擦接種生長(zhǎng) 7 天的幼苗的第一葉和第二葉，7 天后，大麥的第三葉和第四葉首次出現(xiàn)明顯的白化癥狀。在小麥中白化現(xiàn)象也發(fā)生，但要到病毒接種第 10 天以后才可見(jiàn)（ 見(jiàn)注9 和注 10)。
3. 用 BSMV-VIGS 方法鑒定 R 基因介導(dǎo)的抗病通路中所需要的基因
BSMV 侵染后啟動(dòng) VIGS，而病原菌侵染后啟動(dòng)植物抗性系統(tǒng)。通常二者存在必要的時(shí)間間隔且間隔時(shí)間一般是8 天。
四、目的基因 mRNA 下調(diào)檢測(cè)
1. 實(shí)時(shí)定量 PCR
( 1 ) 為了確定 RNA 誘導(dǎo)的外源基因是否影響目的基因的 mRNA 水平，采用兩對(duì)引物進(jìn)行定量 RT- PCR 檢測(cè)。一對(duì)引物是特異性地針對(duì)目的基因 mRNA 而設(shè)計(jì)的，用于檢測(cè)有效的內(nèi)源 mRNA 水平而非外源基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平。
( 2 ) 第二對(duì)引物擴(kuò)增與靶標(biāo) RNA 沉默無(wú)關(guān)的一個(gè)內(nèi)參基因，如被用作內(nèi)參的甘油醛-3- 磷酸脫氫酶基因（GAPDH，AF251217）。
( 3 ) 為驗(yàn)證試驗(yàn)可重復(fù)性，每個(gè) RNA 樣品進(jìn)行三個(gè)重復(fù)（ 三個(gè) cDNA) 。
( 4 ) 可以用 ABI PRISM 7700 序列檢測(cè)系統(tǒng)（ Applied Biosystems) 及 ?SYBR GreenPCR 檢測(cè)混合物 （ Applied ?Biosystems) 進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)。在終體積 26 μl 的反應(yīng)體系中加入 cDNA 模板以及合適的引物。擴(kuò)增條件：50°C，2 min；95℃，10 min；95°C，15s、60°C，1 min，40 個(gè)循環(huán)。
2. 小干擾 RNA 檢測(cè)
( 1 ) 用看家基因 GAPDH（AF251217，甘油醛-3- 磷酸脫氫酶）作為對(duì)照進(jìn)行雜交。
( 2 ) 轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物中雜交信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度可以用磷屏（ phosphoimager) ( Cyclone ?gene ?array ? system, ?Perkin- Elmer, ?Boston) 檢測(cè)。
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焦點(diǎn)事件
