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細胞分離純化—Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細胞

2019.4.05
實驗方法原理常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H）分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，水性高，平均分子量為400000，當密度為1.2 g/ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。
實驗材料

淋巴細胞分離液血清肝素

試劑、試劑盒

肝素Hank's液PBS

儀器、耗材

滴管吸管針頭碘酒酒精棉球止血帶計數(shù)板顯微鏡離心機

實驗步驟

1. ?在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。

　　
2. ?取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000 rpm×20 分鐘。

　　
3. ?離心后管內分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。

　　
4. ?用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5 倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10 分鐘，洗滌細胞兩次。

　　
5. ?末次離心后，棄上清，加入含有10 ％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2 ％臺盼蘭染液混合，于血球計數(shù)板上，計數(shù)四個大方格內的細胞總數(shù)。

　

　　　　　　　　　 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4個大方格內細胞總數(shù)

單個核細胞濃度（細胞數(shù)/1 毫升細胞懸液）＝────────×104×2（稀釋倍數(shù)）

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?4

　　
6. ?細胞活力檢測

死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數(shù)200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。

?

　　　　　　 ? 活細胞數(shù)

活細胞百分率＝──────　×100 ％

　　　　　　　總細胞數(shù)
?

用本法分離PBMC，純度在90 ％以上，收獲率可達80～90 ％，活細胞百分率在90 ％以上。　

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注意事項

1. ?抽取人外周靜脈血時要注意無菌操作。

　　
2. ?操作全程應盡可能短時間內完成，以免增加死細胞數(shù)。

　　
3. ?用淋巴細胞分離液分離PBMC時，離心機轉速的增加和減少要均勻、平穩(wěn)，使保持清晰的界面。

　　
4. ?小鼠、兔等動物淋巴細胞比重與人不同，配制相應密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。

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其他

一、附錄


1. ?Hank's液（無Ca2＋、Mg2＋）配制法


NaCl 8.0 克，KCl 0.4 克，Na2HPO4·12H2O 0.12 克，KH2HPO40.06 克，葡萄糖1.0 克，雙蒸水1000 毫克，1％酚紅液2 毫克

　　
將上列成分混合后溶化，分裝于500 毫升鹽水瓶內，8 磅15 分鐘滅菌，4 ℃冰箱保存，臨用時調PH至7.3～7.6。

　　
2. ?細胞分層液配制法


9 ％聚蔗糖24 份，34 ％泛影葡胺10 ％

　　
混合，測比重為1.077～1.078，G5玻璃濾器過濾除菌。4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

　　
3. ?磷酸緩沖液（PB）

原液


A液

0.2 M NaH2PO4溶液，NaH2PO4?27.6 克，或NaH2PO4·2H2O 31.2 克，蒸餾水，溶解至1000 毫升

　　
B液

0.2 M Ha2HPO4溶液，Ha2HPO4·12H2O 71.6 克，蒸餾水溶解至1000 毫升　


各種不同PH值PB的配法

───────────────────────────────────────

　PH　　　　7.0 ? ?7.2 ? ?7.4 ? ?7.6 ? 7.8 ? 8.0

───────────────────────────────────────

A液（ml） ? ? 39.0 ?28.0 ?19.0 ?13.0 ?8.5 ?5.5

B液（ml） ? ? 61.0 ?72.0 ?81.0 ?87.0 91.0 94.5

───────────────────────────────────────


舉例
0.1 M 　PH7.2PB

A液28 毫升，B液72 毫升，加蒸餾水100 ml

　　
4. ?血球保存液

　
葡萄糖2.05 克，枸椽酸鈉0.8 克，氯化鈉0.42 克，蒸餾水100 毫升

　
將上述成分混勻，略加溫使其溶解，分裝小瓶（100毫升）。經10 磅、10 分鐘高壓滅菌。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

　　
5. ?培養(yǎng)液配置

?

（1）RPMI-1640培養(yǎng)液
?

RPMT-1640（FLOW公司出品）1 袋，三蒸水1000 毫升，電磁攪拌30 分鐘：1N HCl 調PH7.2～7.4（約加2.5 毫升），過濾除菌，作無菌試驗，4 ℃保存。

　　
（2）不完全RPMI-1640培養(yǎng)液
?

RPMI-1640 95 毫升，0.1M丙酮酸鈉 1 毫升，0.2 M谷氨酰胺 1 毫升，1 M　Hepes 1 毫升，7.5 ％ NaHCO3?1 毫升，青霉素、鏈霉素（各1萬單位）1 毫升

　　
（3）完全RPMI-1640培養(yǎng)液
?

不完全1640培養(yǎng)液90 毫升，滅活胎牛（或新生牛）血清10 毫升

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