總RNA提取試劑（Trizol法）使用說明
『用途與特點』
1.? ? 本試劑盒可用于幾乎所有新鮮或液氮保存的動物和植物組織、昆蟲和細胞RNA的快速提取，通用性好。
2.? ? 無須DNA酶、RNA酶抑制劑等。
3.? ? 所需樣品量少，并且可根據起始材料的多少自行調整。
4.? ? 操作簡便，整個過程<1h。
5.? ? 提取的RNA純度高，無蛋白質和DNA污染，不需要其它處理立即可用于下游實驗如RT-PCR擴增、Northern印跡分析、點印跡雜交、Poly(A)+選擇、體外翻譯、RNA酶保護實驗及分子克隆等。
『自備試劑』
異丙醇；無RNase的75%乙醇；DEPC處理H2O；3M醋酸鈉；氯仿。
『注意事項』
1.? ? 嚴防操作環境、使用的容器耗材和試劑的RNase污染。所用器具與耗材進行無RNase處理。操作過程中勤換手套。
2.? ? 過多或過少都有可能影響RNA的質量或產率。若起始材料量很少，RNA預計產量很低，在異丙醇沉淀時，可加入20mg/ml肝糖原溶液0.5~1μl協助RNA沉淀。
3.? ? 將RNA溶于TE緩沖液中(pH7.5-8.2之間)檢測其在OD260的光吸收，不要將RNA稀釋在蒸餾水或DEPC水中檢測OD260。
4.? ? 請勿直接接觸皮膚或吞咽，以免灼傷。如接觸皮膚應立即用溫和的洗滌劑和大量水沖洗。忌用乙醇擦洗，乙醇會加重灼傷程度。如有不適，請馬上尋求醫生的幫助。
5.? ? 本產品僅供科研使用。請勿用于醫藥、臨床治療、食品等用途。
『操作步驟』
1.? ? 裂解處理：
①? ? 動物/植物組織、昆蟲：
25-100 mg液氮冷凍或新鮮的組織，放入存有液氮的研缽里 ，立即研磨至粉狀（在研磨過程中研缽內最好始終保持有液氮）。研好后直接向此研缽內加入1ml 總RNA提取試劑，繼續研磨成粉狀。稱取
② 細胞
1）懸浮培養的細胞：
? 離心沉淀收集細胞，每5-10×106動物、植物和酵母細胞加1ml 總RNA提取試劑。加入總RNA提取試劑前最好不要洗滌細胞，以免增加mRNA降解及RNA酶污染的可能性。
2）貼壁培養的細胞：
直接在培養板中加入總RNA提取試劑裂解細胞，每10cm2面積加1ml 總RNA提取試劑。用取樣器吹打幾次。
注：總RNA提取試劑的用量根據培養皿的面積決定，而不是由細胞數決定的。如果總RNA提取試劑加量不足，可能導致提取的RNA中有DNA污染。如果裂解物用槍頭吸起來時很粘稠，往往需多加點總RNA提取試劑。
2.? 室溫放置 5-10min使其充分裂解，至融化成液態后移入無RNase的1.5ml離心管（在研磨成粉狀后直到室溫融合成液態的過程中不可以再用研磨杵攪動，不然會產生DNA污染）。注：此時可放入-70℃長期保持。
3.? 把上述液體移入1.5ml離心管中，并向其中加入200μl氯仿，蓋上管蓋。劇烈振蕩混勻后室溫放置5min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA 斷裂。
4.? 4℃ 12,000 rpm 離心 15min。樣品分為三層：底層為粉紅色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要存在水相中。
5.? 小心吸取上層水相至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面。
6.? 向離心管中加入等體積的異丙醇和1/10體積 3M的醋酸鈉，上下輕柔顛倒混勻，-20℃放置15-20min。
7.? 4℃ 14000 rpm離心15min，倒掉上清，注意不要觸到沉淀。離心前RNA沉淀經常是看不見的，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。
8.? 加入200ul的75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃ 離心2-3min棄上清。盡量棄上清。
9.? 把離心管放置于超凈臺晾至約2-3min（勿完全干燥）。加入30-50μl的無RNase的水。振蕩30sec，瞬時離心。
10. 將提取的RNA立即進行下游實驗，或放-70℃保存。
