張永振組發Nature：2019-nCoV與中國正爆發的呼吸道疾病有關
嚴重急性呼吸綜合征（SARS）和寨卡（Zika）等新興傳染病對公共衛生構成了重大威脅。盡管進行了廣泛的研究，但是如何、何時和何地出現新疾病仍然具有相當大的不確定性。最近在中國湖北省武漢市報道了一種嚴重的呼吸系統疾病。自第一位患者于2019年12月12日住院以來，截至2020年1月25日，已報道了至少1975例病例。流行病學調查提示著此次疫情爆發與武漢的一家海鮮市場有關。
在一項新的研究中，來自中國復旦大學、中國疾病預防控制中心、華中科技大學和武漢市疾病預防控制中心的研究人員研究了一名在這家海鮮市場工作的患者，該患者于2019年12月26日入住武漢市中心醫院，出現了嚴重的呼吸綜合征，包括發燒、頭暈和咳嗽。相關研究結果于2020年2月3日在線發表在Nature期刊上，論文標題為“A new coronavirus associated with human respiratory disease in China”。重要的是，Nature期刊在2020年1月7年收到這篇論文的手稿，1月28日就接受了這篇論文，并以“加快評審文章（Accelerated Article Preview）”的形式在線發表了這篇論文。論文通訊作者為復旦大學公共衛生學院張永振（Yong-Zhen Zhang）教授。
這名接受研究的患者是一名41歲的男性，無肝炎、結核病和糖尿病病史。他在病發六天后即2019年12月26日入住武漢市中心醫院。這名患者在就診一周后就出現發燒、胸悶，無力咳嗽、疼痛和虛弱。心血管、腹部和神經系統檢查均正常。觀察到輕度的淋巴細胞減少（每立方毫米少于900個細胞），但在全血細胞計數（CBC）測試中，白細胞和血小板計數正常。在血液化學測試中，觀察到C反應蛋白（CRP，血液41.4 mg/L，參考范圍0～6 mg/L）升高，并且天冬氨酸轉氨酶、乳酸脫氫酶和肌酸激酶的水平略有升高。動脈血氣（ABG）測試顯示這名患者患有輕度低氧血癥，血氧水平為67mmHg。在入院的第一天（發病后第6天），胸部X線照片異常，伴有氣腔陰影，如磨玻璃樣陰影，雙肺局灶性實變和斑片狀實變。CT掃描顯示雙側局灶性實變、大葉性實變和斑片狀實變，尤其是下肺。胸部X線照片顯示入院后第5天（發病后第11天）雙側彌漫性斑塊狀的模糊陰影。
通過商業病原體抗原檢測試劑盒開展的初步病原學調查排除了流感病毒、肺炎衣原體和肺炎支原體的存在，并利用PCR進行了確認。其他常見的呼吸道病原體，包括腺病毒，通過qPCR測試也是陰性。盡管進行了抗生素、抗病毒藥物和糖皮質激素的聯合治療，但是這名患者表現出呼吸衰竭，并接受了高流量無創通氣。在治療三天后，這名患者的病情沒有改善，被送進了重癥監護室（ICU）。這名患者入院6天后被轉移到武漢的另一家醫院接受進一步治療。
武漢市疾病預防控制中心流行病學調查顯示，這名患者在當地的一家室內海鮮市場工作。值得注意的是，除魚類和貝類外，在這次疫情開始之前，這家海鮮市場上還出售各種活的野生動物，包括刺猬、獾、蛇和鳥類（斑鳩），以及動物尸體和動物肉。沒有蝙蝠在銷售。盡管這名患者可能與這家海鮮市場上的野生動物接觸過，但是他回憶說，他沒有接觸活禽。
為了研究與這種疾病相關的可能病原體，這些研究人員收集了支氣管肺泡灌洗液（BALF）并進行了深度宏轉錄組測序。這名患者的臨床樣本在上海公共衛生臨床中心的生物安全3級實驗室中進行處理。從200μl BALF樣本中提取總RNA，并使用Illumina MiniSeq進行雙端（150 bp）測序，從而構建出宏轉錄組文庫。他們總共產生了56565928個讀取序列（sequence read），從頭開始組裝這些讀取序列并篩選潛在的病原體。在利用Megahit組裝出的384096個片段重疊群（contig）中，最長的片段重疊群（30474個核苷酸[nt]）具有很高的豐度，并且與之前在中國采樣獲得的蝙蝠SARS樣冠狀病毒分離株bat-SL-CoVZC45（GenBank登錄號MG772933）具有密切的親緣關系，核苷酸序列同一性為89.1％。這種新型病毒的基因組序列及其末端分別通過RT-PCR9和5'/3' RACE Kit（TaKaRa）加以確定和確認。它被命名為WH-Human 1冠狀病毒（WHCV，也被稱為2019-nCoV）。它的全基因組序列（29903 nt）的GenBank登錄號為MN908947。將這些RNA測序（RNA-seq）數據與這種組裝出的WHCV完整基因組進行重新映射導致123613個讀取片段發生組裝，并且在平均深度為6.04X（范圍：0.01X-78.84X）的條件下可實現99.99％的基因組覆蓋率。定量PCR（qPCR）估計BALF樣本中的病毒載量為3.95×108拷貝/mL。
通過與β冠狀病毒屬的兩個代表性成員---人類起源的冠狀病毒（SARS-CoV Tor2，AY274119）和蝙蝠起源的冠狀病毒（Bat-SL-CoVZC45，MG772933）---進行序列比對，這些研究人員描述了WHCV的病毒基因組結構特征。基于這種序列比對和開放閱讀框（ORF），對WHCV的非翻譯區（UTR）和ORF進行了定位。WHCV病毒基因組類似于這兩種冠狀病毒（圖1），它的基因次序為：5'-replicase ORF1ab-S-envelope(E)-membrane(M)-N-3'。WHCV具有典型的β冠狀病毒的5'和3'末端序列，5'末端有265 nt，3'末端有229 nt。這個預測的WHCV ORF1ab基因（編碼復制酶）長度為21291 nt，包含16個預測的非結構蛋白（NSP），隨后是（至少）13個下游ORF。此外，WHCV和SARS-CoV在nsp1中具有一個高度保守的結構域（LLRKNGNKG：氨基酸122-130）。WHCV的S、ORF3a、E、M和N基因的預測長度分別為3822 nt、828 nt、228 nt、669 nt和1260 nt。除了Sarbecovirus亞屬的所有成員都具有這些ORF區域之外，WHCV與SARS-CoV之所以相類似是因為它攜帶一個預測的位于M基因（編碼包膜蛋白的ORF）和N基因之間的ORF8基因（長度為366 nt）。WHCV ORF的功能是根據已知的冠狀病毒序列預測的。與SARS CoV Tor2類似的是，一個前導轉錄調控序列（TRS）和9個假定的TRS可以很容易地在WHCV ORF的5’端上游鑒定出來，其中假定的保守性TRS核心序列以兩種形式---ACGAAC和CUAAAC---之一出現。
圖1.SARS-CoV、WHCV和包括Tor2和CoVZC45在內的SARS樣冠狀病毒的基因組結構。圖片來自Nature, 2020, doi:10.1038/s41586-020-2008-3。
為了確定WHCV與先前鑒定的冠狀病毒之間的進化關系，這些研究人員基于整個基因組序列的核苷酸序列、非結構蛋白基因ORF1a和ORF1b以及S、E、M和N基因編碼的主要結構蛋白，估算了系統進化樹（圖2）。在所有系統進化樹中，WHCV與Sarbecovirus亞屬的成員（包括導致2002-2003年全球SARS 疫情的SARS-CoV）以及從蝙蝠中采集的許多SARS樣冠狀病毒簇集在一起。然而，根據所使用的基因不同，WHCV在Sarbecovirus亞屬內的拓撲位置發生變化，這提示著這組病毒在過去發生了重組事件（圖2）。具體而言，在S基因系統進化樹中，WHCV與蝙蝠冠狀病毒bat-SL-CoVZC45存在最為密切的親緣關系，氨基酸一致性為82.3％，而與SARS-CoV的氨基酸一致性大約為77.2％）；在ORF1b系統進化樹中，WHCV下降至Sarbecovirus亞屬內的基礎位置（圖2）。這種拓撲劃分（topological division）可能反映了蝙蝠病毒Sarbecovirus之間發生的重組事件，也在利用復制酶多蛋白pp1ab的保守結構域估算的系統進化樹中觀察到。
圖2.WHCV及相關冠狀病毒的ORF1a、ORF1b、E基因、M基因核苷酸序列的最大似然系統進化，圖片來自Nature, 2020, doi:10.1038/s41586-020-2008-3。
為了更好地了解WHCV感染人類的潛力，將它的刺突蛋白（S）的受體結合結構域（RBD）與SARS-CoV和蝙蝠SARS樣冠狀病毒中的RBD進行了比較。WHCV的RBD序列與SARS-CoV的RBD序列（氨基酸一致性為73.8％～74.9％）和包括毒株RB4874、Rs7327和Rs4231在內的能夠利用人ACE2受體進入細胞的SARS樣冠狀病毒（氨基酸一致性為75.9％～76.9％）存在更為密切的親緣關系。此外，WHCV RBD僅比SARS-CoV RBD長一個氨基酸。相反，與SARS-CoV相比，包括毒株Rp3在內的不能使用人ACE211的其他蝙蝠SARS樣冠狀病毒在473-477和460-472位點發生氨基酸缺失。先前確定的與人ACE2（PDB 2AJF）結合在一起的SARS-CoV RBD的晶體結構顯示，區域473-477和460-472與人ACE2直接相互作用，因此可能在確定物種特異性中起著重要的作用。
這些研究人員使用SWISS-MODEL服務器進行蛋白同源性建模來預測WHCV、Rs4874和Rp3 RBD結構域的三維蛋白結構，并將它們與SARS-CoV RBD結構域的晶體結構（PDB 2GHV）進行了比較。與序列比對相一致的是，WHCV和Rs4874 RBD結構域的預測蛋白結構與SARS-CoV的RBD結構域存在密切的親緣關系，但與Rp3 RBD結構域的預測蛋白結構不同。此外，相比于可以結合唾液酸的其他人類冠狀病毒（HKU1和OC43），WHCV S蛋白的N末端與SARS-CoV S蛋白的N末端更相似。總之，WHCV和SARS-CoV RBD結構域在氨基酸序列和預測的蛋白結構方面存在高度相似性，這就表明WHCV可能有效地利用人ACE2作為細胞進入受體，從而潛在地促進人與人之間的傳播。
為了進一步表征Sarbecovirus病毒的進化史中發生的推定重組事件，這些研究人員使用了重組檢測程序v4（Recombination Detection Program v4, RDP4）分析了WHCV和四種代表性冠狀病毒---蝙蝠SARS樣冠狀病毒 Rp3，CoVZC45，CoVZXC21和SARS-CoV Tor2---的全基因組序列。盡管相似性圖提示著WHCV和SARS-CoV或SARS樣冠狀病毒之間可能發生重組事件，但沒有明顯的證據表明整個基因組都發生重組。然而，在WHCV和SARS-CoV和蝙蝠SARS樣冠狀病毒（WIV1和RsSHC014）的S基因中檢測到一些在過去發生重組事件的證據（p<3.147×10-3 to p<9.198×10-9），而且相似性圖提示著在將WHCV S基因分為三個區域的核苷酸1029和1652處存在重組斷裂點（圖3）。在片段（nt 1～1029）和片段（nt 1652至S基因序列末端）的系統進化樹中，WHCV與蝙蝠冠狀病毒Bat-SL-CoVZC45和Bat-SL-CoVZXC21存在最為密切的親緣關系，而在片段（nt 1030～1651）的系統進化樹中，WHCV與能夠直接人際傳播的SARS-CoV和蝙蝠SARS樣冠狀病毒（WIV1和RsSHC014）劃分在一起。盡管這些重組事件似乎在Sarbecovirus病毒中比較常見，但沒有證據表明重組促進了WHCV的出現。
圖3.Sarbecovirus病毒的S基因可能發生的重組事件，圖片來自Nature, 2020, doi:10.1038/s41586-020-2008-3。
冠狀病毒與人類的許多傳染病疫情有關，包括2002～2003年的SARS和20121年的MERS。其他的四種冠狀病毒---人類冠狀病毒HKU1、OC43、NL63和229E---也與呼吸系統疾病有關。盡管自2005年以來在中國在包括蝙蝠在內的哺乳動物中廣泛發現了SARS樣冠狀病毒，但是感染人類的冠狀病毒的確切來源仍不清楚。
在這篇論文中，這些研究人員從中國武漢市一名患有嚴重呼吸系統疾病的患者的BALF樣本中描述了一種新型冠狀病毒：WHCV（2019-nCoV）。系統進化樹分析表明WHCV是β冠狀病毒屬（Sarbecovirus亞屬）中的一種新型病毒，因此與SARS-CoV1表現出一些基因組和系統進化相似性，尤其是在RBD中。2019-nCoV與SARS-CoV之間存在的基因組和臨床相似性，以及它在臨床樣本中的大量存在，為WHCV與武漢市正在發生的呼吸道疾病疫情之間存在關聯性提供了證據。盡管僅從一名患者中分離出這種病毒不足以得出導致呼吸道癥狀的結論，但是這些發現已在其他患者中得到獨立證實。
蝙蝠中多種SARS樣冠狀病毒的鑒定導致人們認為這些動物是這些病毒的天然宿主。盡管在中國的蝙蝠中廣泛發現了SARS樣冠狀病毒，但尚未記錄到與SARS-CoV相同的病毒。值得注意的是，WHCV與蝙蝠冠狀病毒存在最為密切的親緣關系，甚至在nsp7和E蛋白方面與Bat-SL-CoVZC45表現出100％的氨基酸相似性。因此，這些數據表明蝙蝠可能是WHCV的宿主。但是，由于首次報道這種疾病時這家海鮮市場上有多種動物在出售，因此需要開展更多的研究工作來確定WHCV的天然宿主和中間宿主。
參考資料：
Fan Wu et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, 2020, doi:10.1038/s41586-020-2008-3.
