數(shù)字PCR緣何是PCR的未來(lái)？群雄逐鹿，幾分天下？
新冠疫情之下，“測(cè)核酸”已成為全民熱詞，PCR作為測(cè)核酸的官宣儀器也火爆熱賣，這里指的是熒光定量PCR（qPCR）。大家知道，有時(shí)的“漏檢”是因?yàn)椴《镜腸opy數(shù)太低；而若想減少甚至消除“漏檢”，可用另一種更靈敏更精準(zhǔn)的數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)。dPCR和qPCR到底有何區(qū)別？為什么說(shuō)dPCR的效果更好？它能解決哪些問(wèn)題？國(guó)內(nèi)外有哪些dPCR的玩家？本文將揭秘dPCR的前世今生，并對(duì)市場(chǎng)上dPCR的代表性產(chǎn)品逐一展示，希望能為您下次入囊前做點(diǎn)兒準(zhǔn)備。
PCR定量發(fā)展簡(jiǎn)史
PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），它以DNA雙鏈復(fù)制原理為基礎(chǔ)，對(duì)特定核酸樣本進(jìn)行體外擴(kuò)增，能夠?qū)⑽⒘康暮怂針颖狙杆倏截愔翈装偃f(wàn)倍。自1985年美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis發(fā)明PCR以來(lái)的三十多年，PCR經(jīng)歷了三代技術(shù)的發(fā)展。第一代傳統(tǒng)PCR技術(shù)，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性分析；第二代熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR進(jìn)程，最后用進(jìn)入擴(kuò)增指數(shù)期時(shí)的Cq值（羅氏）或Ct值（AB/賽默飛）對(duì)基因進(jìn)行定量分析。
為何第一代PCR只能定性？這是因?yàn)镻CR反應(yīng)事實(shí)上呈現(xiàn)S型，在反應(yīng)終點(diǎn)區(qū)測(cè)定終點(diǎn)產(chǎn)物的數(shù)量誤差很大，因此只能定性。第二代qPCR利用拐點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量定量，重現(xiàn)性好，當(dāng)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線后，可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。這同分析化學(xué)上講的定量方法并無(wú)區(qū)別，實(shí)現(xiàn)定量，需要找到標(biāo)準(zhǔn)樣品，需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖1 利用拐點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量進(jìn)行定量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR
圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量
下面我們重點(diǎn)說(shuō)說(shuō)神奇的第三代數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)，這種定量技術(shù)，既不需要標(biāo)準(zhǔn)品，也不需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)起始樣本的絕對(duì)定量，靈敏度和準(zhǔn)確度還特別高。縱觀當(dāng)今分析技術(shù)，唯有dPCR可以實(shí)現(xiàn)不需標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對(duì)定量，足可笑傲定量江湖，用降維打擊、一舉封神、YYDS等各種贊譽(yù)來(lái)形容它都挺合適。
dPCR的基本原理是：通過(guò)將PCR反應(yīng)液進(jìn)行有限稀釋，實(shí)現(xiàn)核酸分子的單分子擴(kuò)增，最終采取終點(diǎn)法檢測(cè)陽(yáng)性微滴的熒光信號(hào)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為 1；沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為 0，因此該技術(shù)被稱為數(shù)字PCR。簡(jiǎn)而言之，就是把復(fù)雜的定量工作簡(jiǎn)化成“1”和“0”，沒(méi)有尋找標(biāo)準(zhǔn)品的困擾，沒(méi)有做標(biāo)準(zhǔn)曲線的煩惱，把所有人為誤差統(tǒng)統(tǒng)丟掉，這就是dPCR被譽(yù)為PCR技術(shù)之未來(lái)的底氣。
數(shù)字PCR的誕生
1992年，Sykes等在檢測(cè)復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因時(shí)，利用樣品的有限稀釋，讓每個(gè)微孔只獲得單個(gè)模板分子，通過(guò)計(jì)算PCR后的擴(kuò)增信號(hào)，以期準(zhǔn)確確定原始分子的數(shù)量，雖然沒(méi)有明確提出“數(shù)字PCR”的概念，但是已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實(shí)驗(yàn)流程，并且確定了數(shù)字PCR檢測(cè)中一個(gè)極其重要的原則——以“終點(diǎn)信號(hào)的有或無(wú)”作為定量方法，這是數(shù)字PCR的雛形。1999年，霍普金斯大學(xué)的Bert Vogelstein和他的同事Kenneth Kinzler等在分析癌癥突變的罕見(jiàn)基因型過(guò)程時(shí)，因受到體細(xì)胞基因的干擾，而遇到檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)分辨率的瓶頸，采用了在384孔板中對(duì)每個(gè)反應(yīng)孔的樣品量進(jìn)行極限稀釋并增加反應(yīng)孔數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的方式，從而明確提出了數(shù)字式PCR的概念，同時(shí)也提出如果采用更多孔板其檢測(cè)靈敏度會(huì)更高，從而指出了dPCR系統(tǒng)的發(fā)展方向。
dPCR是PCR技術(shù)上里程碑式的飛躍，其概念被提出后，受限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，如樣本稀釋及分配都是靠手工來(lái)完成的，干擾和限制因素較多；并且結(jié)果分析對(duì)于研究者來(lái)說(shuō)也十分枯燥與繁瑣，因此在很長(zhǎng)一段時(shí)間dPCR發(fā)展停滯不前。后來(lái)由于微流控技術(shù)與微納集成制造工藝的發(fā)展解決了dPCR應(yīng)用過(guò)程中的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，推動(dòng)了dPCR的研究與商業(yè)化的發(fā)展。
細(xì)說(shuō)dPCR原理
數(shù)字PCR的基本原理是：將稀釋的核酸樣品分配到大量獨(dú)立的微反應(yīng)單元，進(jìn)行大規(guī)模單拷貝PCR擴(kuò)增反應(yīng)和基于泊松分布（Poisson distribution）的絕對(duì)定量分析。與RT-qPCR不同，dPCR不需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可實(shí)現(xiàn)目的核酸拷貝數(shù)的絕對(duì)定量。dPCR平臺(tái)是基因和細(xì)胞治療的標(biāo)配，在載體開(kāi)發(fā)中可以用作質(zhì)量控制檢測(cè)。
目前根據(jù)dPCR樣本稀釋分配的方式，基本可分為三大類，一種是基于大規(guī)模集成的微流控芯片；第二種是使用微反應(yīng)室/孔板；第三種是基于液滴式。其中后者是近年來(lái)dPCR分析儀的主流。液滴數(shù)字PCR（ddPCR）是一種基于水油乳液液滴技術(shù)的dPCR方法，其將樣品分餾成20,000個(gè)液滴，并在每個(gè)液滴中發(fā)生模板分子的PCR擴(kuò)增。ddPCR 技術(shù)使用的試劑和工作流程與大多數(shù)基于TaqMan探針的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)有著相似的試劑和工作流程。大規(guī)模樣本分區(qū)是dPCR 技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵方面，不論是芯片式還是液滴式，其基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或者液滴當(dāng)中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于1或者等于1。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，可以推算出原始溶液的核酸濃度。
圖3 液滴dPCR檢測(cè)原理
數(shù)字PCR的主要技術(shù)特點(diǎn)
dPCR具有靈敏度高（可達(dá)0.001-0.0001%），特異性強(qiáng)，可檢測(cè)復(fù)雜背景下的靶標(biāo)序列；可高度耐受PCR反應(yīng)抑制劑，如SDS（十二烷基磺酸鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、Heparin（肝素，血液抗凝劑）等；不必依賴對(duì)照品或標(biāo)準(zhǔn)品，可對(duì)目標(biāo)拷貝數(shù)直接進(jìn)行精確定量，分析微小的濃度差異；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析便捷，每個(gè)微滴的檢測(cè)結(jié)果以陰性、陽(yáng)性判讀，數(shù)據(jù)分析自動(dòng)化；可統(tǒng)計(jì)突變率，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析可得出靶點(diǎn)的突變率。
作為近年來(lái)興起的分子診斷分析技術(shù)，dPCR在應(yīng)用技術(shù)上還存在需要改進(jìn)的地方，如通量較低，一般單個(gè)反應(yīng)2重反應(yīng)效果最佳；dPCR優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，但是對(duì)于DNA濃度大的樣本來(lái)說(shuō)優(yōu)勢(shì)就不能體現(xiàn)，而且核酸濃度高時(shí)，每個(gè)微滴里面包含的拷貝數(shù)不符合泊松分布；dPCR雖然不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是每次反應(yīng)之間存在差異，短期內(nèi)不能完全取代qPCR，也不能代替其他金標(biāo)準(zhǔn)方法。
數(shù)字PCR儀在細(xì)分領(lǐng)域的應(yīng)用前景
dPCR技術(shù)的出現(xiàn)不是為了完全取代原有分子診斷技術(shù)，而是更好的補(bǔ)充和完善現(xiàn)有技術(shù)平臺(tái)。dPCR為不同應(yīng)用場(chǎng)景下的多樣化核酸檢測(cè)需求提供了新的思路，尤其是在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面，在感染性疾病早期檢測(cè)、癌癥的液體活檢、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
dPCR的優(yōu)勢(shì)與臨床應(yīng)用前景已在許多研究中得到確認(rèn)，但最終實(shí)現(xiàn)在臨床上的廣泛應(yīng)用，需要以下幾個(gè)方面進(jìn)行升級(jí)：商用dPCR系統(tǒng)需要進(jìn)一步提升樣本檢測(cè)通量以充分滿足病毒篩查的需求；需要制定國(guó)家或行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。目前新羿生物已經(jīng)推動(dòng)了dPCR的地方標(biāo)準(zhǔn)（DB 32/T3762.16-2001 新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第16法：核酸數(shù)字PCR），用于新冠病毒檢測(cè)；需要產(chǎn)業(yè)界進(jìn)一步降低設(shè)備成本；基于dPCR的新冠檢測(cè)試劑盒需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格評(píng)價(jià)，并獲得NMPA、FDA、CE等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)證才可投放國(guó)內(nèi)或海外市場(chǎng)。
實(shí)現(xiàn)感染性疾病早期高效檢測(cè)——以新冠病毒為例
（1）病毒檢測(cè)。qPCR檢測(cè)技術(shù)是目前新冠病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于病毒探針結(jié)合位點(diǎn)突變、樣本病毒載量不足等原因，在臨床檢測(cè)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，由于dPCR具有更高的靈敏度、精準(zhǔn)度，以及其適合痕量樣本檢測(cè)的特性，能夠糾正RT-qPCR檢測(cè)出的“假陰性”結(jié)果，作為后者的補(bǔ)充方法。
（2）臨床樣本病毒載量評(píng)估。在人群篩查及臨床診療中，為科學(xué)選取采樣方式，需要評(píng)估不同臨床樣本病毒載量，如鼻咽拭子、血尿、糞便、肺泡灌洗液等，由于dPCR可提供絕對(duì)量化指標(biāo)，為采樣方法的選取提供了參考，從而提高檢出率。
（3）監(jiān)測(cè)環(huán)境病毒載量。在外防輸入的戰(zhàn)略要求下，環(huán)境病毒檢測(cè)尤為重要。dPCR可對(duì)低核酸豐度樣本進(jìn)行有效檢測(cè)，包括從不同環(huán)境中取樣的樣本，如病房、衛(wèi)生間、實(shí)驗(yàn)室等等，在疫情防控中起到了不可忽視的作用。此外，dPCR的應(yīng)用場(chǎng)景還有病程不同階段的病毒載量評(píng)估、核酸參考品制備、抗病毒藥物研發(fā)等環(huán)節(jié)。
助力癌癥液體活檢——實(shí)現(xiàn)患者全病程監(jiān)控
液體活檢是普通癌癥檢測(cè)的延伸和補(bǔ)充方法，將目標(biāo)采取樣本從組織延伸到血液、體液。dPCR可精確檢測(cè)轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞和DNA片段，提供基因突變情況等信息，動(dòng)態(tài)監(jiān)控病人病程的發(fā)展，從而為伴隨診斷和個(gè)性化治療提供可靠依據(jù)。
高效篩查胎兒疾病——提高無(wú)創(chuàng)產(chǎn)檢普及性和依從性
通過(guò)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查，針對(duì)胎兒染色體非整倍體異常、遺傳性基因疾病等進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。目前，大多數(shù)商品化的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查產(chǎn)品都是基于二代測(cè)序的技術(shù)和平臺(tái)，該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)（1-2周出報(bào)告）、技術(shù)門檻高、檢測(cè)費(fèi)用高，阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。而基于dPCR的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的產(chǎn)前篩查。
數(shù)字PCR的市場(chǎng)分布及預(yù)測(cè)
全球市場(chǎng)分布和預(yù)測(cè)
目前數(shù)字PCR市場(chǎng)規(guī)模并不大，全球約1.5億至2.5億美元，占實(shí)時(shí)定量熒光PCR市場(chǎng)總規(guī)模(約20億美元)的10%，但增長(zhǎng)趨勢(shì)顯著，有望在技術(shù)成熟后與目前的qPCR平分江山，甚至逐步替代qPCR技術(shù)。
研究報(bào)告預(yù)測(cè)，2019-2024年全球qPCR和dPCR市場(chǎng)將以8.8%的年復(fù)合增長(zhǎng)率增長(zhǎng)，從2014年的41.13億美元增長(zhǎng)到2024年的62.7億美元。其中，dPCR的增速更快達(dá)11.9%，將從2014年的4.75億美元，增長(zhǎng)到2024年8.34億美元；qPCR的年增速為8.37%，從2014年的36.28億美元，增長(zhǎng)到2024年的54.37億美元。這個(gè)預(yù)測(cè)沒(méi)有料及2020年新冠疫情的爆發(fā)，為PCR檢測(cè)帶來(lái)極大的市場(chǎng)。但圖4的發(fā)展趨勢(shì)還有參考價(jià)值。
圖4 2017年-2024年dPCR全球增長(zhǎng)情況預(yù)測(cè)
從市場(chǎng)的角度來(lái)看，北美依然是dPCR最大的主導(dǎo)市場(chǎng)，其次是亞洲和歐洲。北美市場(chǎng)增長(zhǎng)是由于北美地區(qū)存在慢性病的高患病率和完善的醫(yī)療保健基礎(chǔ)設(shè)施等。此外，有利的政府舉措和研究伙伴關(guān)系數(shù)量的增加，是預(yù)計(jì)市場(chǎng)增長(zhǎng)的驅(qū)動(dòng)因素。
圖5 dPCR全球市場(chǎng)分布
把企業(yè)類型分為三檔，其中第一檔為收入大于10億美元企業(yè)。第二檔為1億至10億美元，第三檔為小于1億美元，分別占有45%，34%，21%，這說(shuō)明該行業(yè)存在巨頭，但是尚未形成壟斷，對(duì)于相對(duì)其他企業(yè)仍有機(jī)會(huì)。dPCR由幾個(gè)主要公司占據(jù)一半的全球市場(chǎng)，包括Bio-Rad Laboratories Inc.，Thermo Fisher Scientific，F(xiàn)luidigm Corporation，QIAGEN，Sysmex Corporation，JN Medsys，Merck KGaA，Stilla和Avance Biosciences等。
圖6 液滴dPCR在癌癥細(xì)分市場(chǎng)的應(yīng)用
ddPCR是近年來(lái)PCR的主流技術(shù)，推動(dòng)細(xì)分市場(chǎng)增長(zhǎng)的因素是癌癥，傳染病的患病率增加以及檢測(cè)中心資金的增加。
中國(guó)市場(chǎng)分布和預(yù)測(cè)
在精準(zhǔn)醫(yī)療、個(gè)性化用藥等需求推動(dòng)下，分子診斷技術(shù)在全球得到飛速發(fā)展。我國(guó)dPCR行業(yè)一直保持著穩(wěn)定快速的增長(zhǎng)。根據(jù)沙利文(Suvillian)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)dPCR行業(yè)市場(chǎng)規(guī)模從2013年的14.6億元增加至2017年的72億元，年復(fù)合增長(zhǎng)率CAGR=29.2%，到2022年市場(chǎng)規(guī)模預(yù)計(jì)將達(dá)到266.6億元人民幣。
圖7 數(shù)字PCR市場(chǎng)規(guī)模預(yù)測(cè)（億元）
（資料來(lái)源：Frost&Suvillian，國(guó)元證券研究中心）
國(guó)內(nèi)dPCR行業(yè)市場(chǎng)規(guī)模持續(xù)快速增長(zhǎng)，主要受到精準(zhǔn)診斷需求增加、技術(shù)突破增加利潤(rùn)、國(guó)家政策支持（國(guó)產(chǎn)替代）等因素影響，未來(lái)dPCR將會(huì)有更大的發(fā)展空間，這是因?yàn)椋?）人口增長(zhǎng)與老齡化：我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)導(dǎo)致腫瘤醫(yī)藥市場(chǎng)增長(zhǎng)和體外檢測(cè)需求增長(zhǎng)，而dPCR在腫瘤檢測(cè)、傳染病檢測(cè)、遺傳病等疾病檢測(cè)上優(yōu)勢(shì)明顯，醫(yī)療市場(chǎng)的擴(kuò)容將進(jìn)一步推動(dòng)dPCR的增長(zhǎng)；（2）國(guó)內(nèi)政策利好：根據(jù)國(guó)家科技部辦公廳發(fā)布的《“十三五”醫(yī)療器械科技創(chuàng)新專項(xiàng)規(guī)劃》，要求重點(diǎn)開(kāi)發(fā)POCT檢測(cè)、新型基因測(cè)序儀、隨檢全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)、定量dPCR等系統(tǒng)；（3）精準(zhǔn)醫(yī)療與腫瘤治療需求：精準(zhǔn)醫(yī)療的基礎(chǔ)在于個(gè)體化醫(yī)療，對(duì)致病突變檢測(cè)和定量分析的精確性要求較高，亟需新一代PCR技術(shù)的應(yīng)用，而數(shù)字PCR在這方面優(yōu)勢(shì)明顯。
數(shù)字PCR的主要產(chǎn)品
自2006年，F(xiàn)luidigm公司推出第一個(gè)商業(yè)化的基于芯片的dPCR儀以來(lái)，數(shù)字PCR儀不斷實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新和突破。在稀釋方式上，主要的是伯樂(lè)為代表的液滴式、以Fluidigm、賽默飛為代表的芯片式和羅氏、凱杰為代表的微板式。國(guó)外dPCR主要是三個(gè)模塊組成的一體機(jī)，而國(guó)內(nèi)大多還是幾臺(tái)儀器分別完成樣本分區(qū)、擴(kuò)增和數(shù)據(jù)讀取。新冠疫情下，dPCR生產(chǎn)商無(wú)不在產(chǎn)品上實(shí)現(xiàn)突破，近年來(lái)新品頻出，直有問(wèn)鼎分子診斷之勢(shì)。
Bio-Rad（伯樂(lè)）
圖8 伯樂(lè)QX ONE ddPCR系統(tǒng)
擁有二十多年P(guān)CR儀研發(fā)、生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的伯樂(lè)公司是全球dPCR市場(chǎng)的領(lǐng)跑者。伯樂(lè)于2011年斥資1.62億美元，完成對(duì)QuantaLife公司的收購(gòu)，正式進(jìn)軍dPCR市場(chǎng)，隨即推出QX100、QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)以及最新的QX One集成液滴數(shù)字系統(tǒng)。2017年，伯樂(lè)又收購(gòu)了ddPCR系統(tǒng)制造商RainDance Technologies，該公司擁有在短時(shí)間內(nèi)生成數(shù)百萬(wàn)個(gè)皮升級(jí)微液滴的核心技術(shù)，可將伯樂(lè)原液滴數(shù)提升250-500倍。兩者的融合進(jìn)一步穩(wěn)固了伯樂(lè)在dPCR領(lǐng)域的領(lǐng)軍地位。
根據(jù)2019年財(cái)報(bào)，伯樂(lè)銷售額收入超23億美元，ddPCR增長(zhǎng)強(qiáng)勁。2020年，Bio-Rad發(fā)布了全球首款數(shù)字PCR一體機(jī)：Bio-Rad的 QX ONE ddPCR系統(tǒng)，整合了微滴生成、熱循環(huán)反應(yīng)及微滴讀取等步驟，最大程度減少人工操作，提高了檢測(cè)通量。配備四個(gè)獨(dú)立的熒光通道，結(jié)合ddPCR特有的高階多重PCR技術(shù)，可以在單反應(yīng)孔中實(shí)現(xiàn)8重拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)、5重突變檢測(cè)或4重基因表達(dá)檢測(cè)。兼容目前QX200 系統(tǒng)中所使用的supermix、assay和kit。
美國(guó)FDA近來(lái)批準(zhǔn)了Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的基于ddPCR技術(shù)的SARS-CoV-2檢測(cè)的緊急使用授權(quán)。
Thermo Fisher Scientific（賽默飛）
圖9 賽默飛QuantStudio? Absolute Q? dPCR 系統(tǒng)
2021年11月，賽默飛推出了基于微流體陣列式芯片技術(shù)的Applied Biosystems? QuantStudio? Absolute Q? dPCR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在20480個(gè)固定納米級(jí)微孔中生成95%以上的有效反應(yīng)液滴，具有更少的死體積，且ROX通道具有質(zhì)控功能，非正常液滴予以排除分析；PCR擴(kuò)增前后信號(hào)采集，自動(dòng)排除假陽(yáng)性。配備3個(gè)LED光源，最多支持5個(gè)熒光檢測(cè)通道，每份樣本中可同時(shí)進(jìn)行多靶標(biāo)檢測(cè)。
Roche（羅氏）
圖10 Digital LightCycler數(shù)字PCR系統(tǒng)
2021年11月，羅氏發(fā)布了基于Digital LightCycler System，在實(shí)驗(yàn)流程上具備高自動(dòng)化的硬件設(shè)計(jì)，擁有6色熒光檢測(cè)通道以及1通道的參比通道，針對(duì)通用檢測(cè)、高靈敏度及高分辨率三種不同的應(yīng)用需求提供不同的納米孔板選擇，可將多至96個(gè)樣本的實(shí)驗(yàn)速度提高至常規(guī)數(shù)字PCR的2倍。
此外，該系統(tǒng)可通過(guò)實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（LIS）對(duì)樣本進(jìn)行信息自動(dòng)化溯源，具有操作簡(jiǎn)便、通量高、速度快、通道全等性能和優(yōu)勢(shì)。
Fluidigm（富魯達(dá)）
圖11 BiomarkTM HD PCR系統(tǒng)
BiomarkTM HD作為一款高性能的PCR系統(tǒng)，利用微流控技術(shù)構(gòu)建納升級(jí)反應(yīng)體系，具有通量靈活、高度自動(dòng)化的特點(diǎn)，整合了基因分型、基因表達(dá)譜、實(shí)時(shí)定量、數(shù)字PCR和單細(xì)胞基因表達(dá)譜分析等應(yīng)用的多功能平臺(tái)。
基于高度集成的IFC微流控芯片，Biomark? HD系統(tǒng)在短短幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即可獲得近萬(wàn)個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，具有顯著的成本和時(shí)間優(yōu)勢(shì)。此外，該系統(tǒng)兼容多種不同規(guī)格的微流控芯片，在單一系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)從中到高通量的實(shí)驗(yàn)需求。Biomark? HD系統(tǒng)能給研究人員提供高通量和靈敏度低至單細(xì)胞水平研究的微流控芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)；該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于實(shí)時(shí)熒光定量和終點(diǎn)PCR兩種檢測(cè)模式最大化該平臺(tái)的靈活性；平臺(tái)開(kāi)放，能與實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)行的Assay兼容，增加實(shí)驗(yàn)靈活性；強(qiáng)大的、用戶友好的Biomark分析軟件使高通量SNP基因分型，基因表達(dá)定量和數(shù)字PCR數(shù)據(jù)分析更精簡(jiǎn)實(shí)用。
Stilla Technologies
圖12 六通道數(shù)字PCR儀
成立于2013年的法國(guó)Stilla Technologies公司，早在2016年首次將三色目標(biāo)多重檢測(cè)引入數(shù)字PCR。2020年又推出了六通道數(shù)字PCR儀，提升了Naica?數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測(cè)能力。Naica系統(tǒng)是一種高度靈敏的數(shù)字PCR解決方案，可在Crystal? 數(shù)字PCR系統(tǒng)上運(yùn)行。它最初具有三通道檢測(cè)能力，如今具有六通道檢測(cè)能力，可鑒定多種類型的核酸，已成為精準(zhǔn)醫(yī)療、伴隨診斷和疾病監(jiān)控的理想工具。該系統(tǒng)簡(jiǎn)單易用，可在不到三小時(shí)內(nèi)快速生成結(jié)果。
QIAGEN（凱杰）
圖13 凱杰QIAcuity系列數(shù)字PCR系統(tǒng)
QIAcuity系列數(shù)字PCR集樣品分區(qū)、PCR擴(kuò)增、信號(hào)檢測(cè)于一體。QIAGEN全新基于納米微孔板的一體化集成數(shù)字PCR系統(tǒng)，QIAcuity適用于對(duì)靶DNA或RNA分子進(jìn)行絕對(duì)定量分析，兼容基于EvaGreen染料法或探針?lè)ǖ臋z測(cè)。QIAcuity采用獨(dú)特技術(shù)，使實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)化至如同qPCR實(shí)驗(yàn)一般簡(jiǎn)單快速。QIAcuity基于納米微孔板技術(shù)，將數(shù)字PCR的樣本液滴制備、擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析集成到全自動(dòng)儀器中，在2小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)從樣本到數(shù)據(jù)解讀全過(guò)程。QIAcuity創(chuàng)新性納米微孔板采用微流體技術(shù)，配置好PCR反應(yīng)體系后，儀器自動(dòng)將樣品壓入微孔板的納米微孔中并對(duì)每個(gè)小孔獨(dú)立密封。納米微孔板技術(shù)可以做到物理分隔，保證分配到每個(gè)納米微孔中的液滴大小均一，無(wú)液滴破裂融合或交叉污染。
領(lǐng)航基因
圖14 全自動(dòng)液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)AD16
領(lǐng)航基因推出的全自動(dòng)液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)AD16，整合液滴生成、PCR擴(kuò)增、多通道熒光檢測(cè)于一體，可自動(dòng)實(shí)現(xiàn)樣本的微滴化處理，快速進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)分析。AD16系統(tǒng)采用微流控芯片和油相表面活性劑，通過(guò)芯片上樣提取的核酸后，即可實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守：完全實(shí)現(xiàn)從“芯片進(jìn)，結(jié)果出”的全自動(dòng)化流程。大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，全程僅約2小時(shí)。全自動(dòng)液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)提供對(duì)靶DNA或RNA分子進(jìn)行絕對(duì)定量的一種方法，系統(tǒng)樣本制備儀和生物芯片閱讀儀實(shí)現(xiàn)與PCR擴(kuò)增模塊無(wú)縫整合，使得數(shù)字PCR系統(tǒng)應(yīng)用更廣泛。自動(dòng)化系統(tǒng)減少了手工操作誤差、使樣本更穩(wěn)定，后期檢測(cè)更準(zhǔn)確，同時(shí)節(jié)約了時(shí)間和成本。領(lǐng)航基因已經(jīng)有多項(xiàng)數(shù)字PCR相關(guān)產(chǎn)品獲得藥監(jiān)局批文。
永諾生物
圖15 MicroDrop-20全新微滴式數(shù)字PCR
永諾生物-MicroDrop-20全新微滴式數(shù)字PCR采用全封閉防污染設(shè)計(jì)，一鍵式自動(dòng)化操作。微滴生成采用油包水乳化微滴技術(shù)，在微管道中利用氣壓驅(qū)動(dòng)，2mins生成數(shù)萬(wàn)個(gè)微滴，高效高產(chǎn)。微滴生成芯片為高精度微流控芯片設(shè)計(jì)，三維微納防污染結(jié)構(gòu)，一張芯片可同時(shí)處理8個(gè)樣本。微滴檢測(cè)使用雙通道熒光，支持EvaGreen染料法及探針?lè)āz測(cè)通量高，可一次檢測(cè)高達(dá)96個(gè)樣本，支持靈活設(shè)定。
臻準(zhǔn)生物
圖16 AccuONE-200 數(shù)字PCR系統(tǒng)
AccuONE系統(tǒng)由上樣、擴(kuò)增和分析三大功能模塊組成，核心技術(shù)涉及微納加工、精密儀器、生物試劑、圖像識(shí)別與算法等；不同規(guī)格芯片微孔數(shù)可達(dá)2萬(wàn)、3萬(wàn)或5萬(wàn)，甚至更高；熒光通道數(shù)最多可達(dá)6個(gè)；系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高。經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)表明，AccuONE系統(tǒng)的精確度和靈敏度等關(guān)鍵指標(biāo)均已達(dá)到國(guó)外主流產(chǎn)品同等水平。上樣系統(tǒng)小巧精致，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化精確上樣，減少了人工操作。一鍵啟動(dòng)，快捷簡(jiǎn)便。通量的提高大幅提升了單日的檢測(cè)極限，在大樣本量的檢測(cè)需求下，用戶也可以從容應(yīng)對(duì)。6色熒光通道配置實(shí)現(xiàn)了多重PCR檢測(cè)，節(jié)約了寶貴的實(shí)驗(yàn)樣本。AccuApp軟件系統(tǒng)簡(jiǎn)單直觀，界面潔簡(jiǎn)友好，極大降低了用戶的上手難度。強(qiáng)大的AI算法加持，配合精確的圖像識(shí)別和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，最終呈現(xiàn)給用戶清晰的圖像和準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。系統(tǒng)具有強(qiáng)大的兼容性和開(kāi)放性，支持多種規(guī)格耗材，適配多種反應(yīng)體系，開(kāi)放的MIX試劑幫助客戶快速高效地開(kāi)發(fā)自己的應(yīng)用產(chǎn)品。
小海龜科技
圖17 BioDigital青/青Pro數(shù)字PCR系統(tǒng)
BioDigital青/青Pro數(shù)字PCR系統(tǒng)無(wú)需人工加樣，真正實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)液滴制備。系統(tǒng)包括液滴制備儀 Loader S200、芯片擴(kuò)增儀 Cycler S200和生物芯片閱讀儀 Imager S200，是完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新產(chǎn)品，單個(gè)樣本支持開(kāi)機(jī)，可并行處理最高96個(gè)樣本，一次樣本用量26μL，有效液滴數(shù)2萬(wàn)-20萬(wàn)，具有更高的檢測(cè)范圍和超高的檢測(cè)靈敏度。系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置4個(gè)熒光通道，可定制第5個(gè)熒光通道，在同類型數(shù)字PCR儀中處于領(lǐng)先地位。熒光通道數(shù)越多，單次反應(yīng)可檢測(cè)基因位點(diǎn)越多。特別在靶向藥研究中，單次檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)增多，使得臨床應(yīng)用更靈活、廣泛。
BioDigital-青系列自動(dòng)化程度高，可靈活組合，滿足多樣化及高通量需求。該系統(tǒng)可對(duì)熒光定量PCR或膠體金檢測(cè)卡檢測(cè)的灰區(qū)樣本進(jìn)行精準(zhǔn)的判讀。目前，小海龜科技已成功開(kāi)發(fā)了40余種液體活檢相關(guān)的檢測(cè)試劑盒，BioDigital青系列數(shù)字PCR兼容第三方qPCR試劑盒，保證了試劑盒開(kāi)發(fā)的高效性，預(yù)期未來(lái)3年內(nèi)將在BioDigital系列數(shù)字PCR平臺(tái)上完成100余種應(yīng)用試劑盒的開(kāi)發(fā)。
新羿生物
圖18 新羿TD-2數(shù)字PCR平臺(tái)
近日，新羿生物5色微滴數(shù)字PCR生物芯片分析儀（TD-2）正式獲得醫(yī)療器械批文（京械注準(zhǔn)20212220583），是全球首款基于流式檢測(cè)的5色微滴數(shù)字PCR分析儀獲得臨床準(zhǔn)入。TD-2數(shù)字PCR的全封閉微滴PCR擴(kuò)增和流式檢測(cè)系統(tǒng)，多重防污染設(shè)計(jì)，熒光檢測(cè)靈敏度高、信噪比好、多指標(biāo)檢測(cè)能力強(qiáng)、液滴數(shù)目不易受限制。
TD-2數(shù)字PCR利用激光準(zhǔn)共聚焦光路高效激發(fā)液滴熒光，在光譜帶寬內(nèi)完成更多熒光通道檢測(cè)，ZL算法消除通道間的熒光串?dāng)_，實(shí)現(xiàn)5色熒光通道同步高速檢測(cè)。
