Percoll細胞分離液的使用方法
實驗概要
掌握Percoll細胞分離液的使用方法。
實驗原理
Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm／kg H２O)，粘度也很小，可形成高達1.3g／mL密度，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(200～1000g)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低，所形成的梯度十分穩定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。
主要試劑
1. 小牛血清
2. Percoll細胞分離液
3. 8.5％NaCl
4. 1.5MPBS
主要設備
1. 高速冷凍離心機(3K-30)
2. 4℃、-20℃冰箱
3. 長針頭注射器
4. 1.5mL和10mL離心管
實驗材料
PBMC細胞
實驗步驟
1. 不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5M PBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。
2. 不連續密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
3. 裝樣：樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高，否則會影響細胞的分離和回收。
4. 離心：一般采用離心力為400g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機加速、降速時要慢，要平穩。
5. 取樣：當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞；有時大部分細胞位于Percoll層中，則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養或檢測用。
舉例：
1. 富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化：按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll，如用10mL試管(或塑料管)分離，每層Percoll約1.2～1.5mL，初步從外周血中分離的PBMC細胞1×108懸于1mL培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
2. 純化淋巴母細胞和除去死細胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC，或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者)，按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞；兩層Percoll之間為淋巴母細胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。
