前言

上期我們進行了免疫熒光原理、實驗步驟的探討，本期我們一起走進免疫熒光常見問題的分析，幫助大家解決在實驗過程中遇到的一些問題，讓大家都能成為免疫熒光小能手。

常見問題

1背景熒光高

① 洗滌不足——充分洗滌，適當增加洗滌次數和時間；

② 樣本干燥——在濕盒中孵育抗體，避免干燥；

③ 抗體濃度過高——預實驗測定最佳濃度；

④ 樣本自發熒光——染色前先行檢測自發熒光情況；

⑤ 封閉不充分——延長封閉時間或更換封閉液；

⑥ 二抗非特異性結合——做一組只加二抗孵育的作為對照；

⑦ 抗體孵育時間過長——嚴格控制孵育時間，適當減少孵育時間；

⑧ 切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長(大于24小時)——有時切片脫蠟至修復會過夜，第二天加抗體進行染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在4oC冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長；

⑨ 熒光背景噪音大——更換熒光顯微鏡，使用能夠降低背景熒光干擾的顯微鏡。

2熒光信號弱

① 熒光通道的激發波長和發射波長與染料不匹配——確保使用的顯微鏡的熒光通道與染料熒光基團的波長相匹配；

② 一抗或二抗不兼容——注意種屬是否正確；

③ 一抗不好用——陽性對照確認抗體有效性；

④ 固定過度或不充分——適當調整固定時間；

⑤ 樣本保存不當導致熒光淬滅——注意保存過程中的濕度和避光；

⑥ 一抗變質或質量差的多克隆抗體——注意抗體有效期，與新買抗體或用過的抗體作比較；

⑦ 信號弱或無信號——可裂解細胞后，用WB驗證目標蛋白在細胞中是否表達；

⑧ 顯微鏡收集熒光和成像的能力差——選擇一款相機配置好、熒光收集能力強、成像效果好的熒光顯微鏡。

3細胞/組織形態被破壞

① 組織從玻片上脫落或有氣泡——適當增加固定時間，封片時注意不要產生氣泡；

② 細胞或組織固定不充分，自發裂解——使用交聯性固定劑，適當增加固定時間；

③ 組織切片撕裂或有褶皺——切片過程導致的問題，考慮重新進行切片。

4定位不對

可使用帶明場通道的熒光顯微鏡進行共定位，如下圖：

① 細胞核干擾——細胞核位置前面的細胞質染色干擾造成，可以降低抗體濃度或孵育時間；

② 細胞或者組織狀態不對——細胞或者組織狀態不同導致目的蛋白細胞定位不同，造成最后的定位不對，可重新培養細胞調整好狀態或者重新取材，進行再次染色；

③ 核定位不對——可將封閉和打孔合為一步，即在封閉液中添加0.5% TRITON-100，37℃封閉2h，加一抗后最好4℃孵育過夜(16h)；

④ 不確定觀察到的是不是需要的染色位置——使用帶明場通道的熒光顯微鏡，進行熒光定位，確定觀察到的染色位置是否正確。

對照實驗設置

1內源性組織背景對照

某些含有固有的生物化學性質的組織或細胞，會產生背景或自發熒光，對結果產生影響。以下圖為例，DAPI染核，FITC染邊界和中間的晶狀結構，而TRITC染整個組織背景的顏色，但綠色也產生了背景熒光，對三通道疊加造成了干擾。

2陰性對照

使用確定不含有待測抗原的細胞或組織，與待測樣本統一處理，同一觀察，結果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性。

3陽性對照

與陰性對照相反，用確定含有待測抗原的細胞或組織，與待測樣本統一處理，同一觀察，結果若為陽性，可證明待測抗原具有活性且實驗過程沒有問題，方法操作可靠。

免疫熒光高清成像

在精心完成免疫熒光后，選擇一款操作簡單、成像清晰、效果卓越的熒光顯微鏡進行觀察拍照，才能輕松得到更為理想的結果圖，達到事半功倍的效果。

Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡作為一款電動化、智能化的顯微鏡，具有以下優勢：

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