背景介紹 

藥物性肝損傷（DILI）會影響肝臟代謝和解毒能力，但其根本機制仍有很多未知。為了準確和可再現地預測人的DILI，非常需要體外肝臟模型來替代昂貴和低通量的2D細胞培養系統、動物研究和芯片實驗室模型。我們提出了一種新的“droplet in droplet”（DID）生物打印方法，該方法可以產生用于肝毒性研究的生理相關肝臟模型。這些模型，或稱微型肝臟，是用BIO X微滴打印包裹在ⅰ型膠原中的肝(HepG2和LX2 肝星狀細胞)和非肝(HUVEC 人臍靜脈血管內皮細胞)細胞制成的。培養7天后，將微型肝臟暴露于急性和高劑量的對乙酰氨基酚或氟他胺，然后評估細胞活力、白蛋白分泌、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活性和脂質積累的變化。微型肝臟ALT活性增加，白蛋白和脂質生成減少，表面這兩種藥物均有細胞毒性反應。這項研究的結果進一步驗證了3D生物打印是一種可行的、可用于模擬肝組織和篩選特異性藥物反應的中到高通量的解決方案。
 

 材料和方法 

細胞準備

根據建議的方案培養兩種肝細胞（HepG2和LX2）和一種非肝細胞（HUVEC）細胞系，并每3-4天傳代一次。HepG2在含有谷氨酰胺的MEMα中生長，并補充1%丙酮酸鈉(Gibco，Cat#11360070)和1%MEM非必需氨基酸溶液(Gibco，Cat-#11140050)。LX2細胞在IMDM(Gibco，Cat#12440053)中生長，HUVEC在EGM-2生長培養基(Lonza，Cat#CC-3156)中培養，并添加單體補充劑(Lonza，Cat#CC-4176)。所有培養基均添加10%的FBS(Gibco，16000044類)和1%的青霉素鏈霉素(Gibco，參考文獻1509-70-063)。
 

生物墨水的制備和DID生物打印

中和并制備3mg/mL濃度的Coll I bioink(CELLINK，SKU#IK4000002001)用于生物打印。以1:1:2（LX2:HUVEC:HepG2）的比例將5x106個細胞/毫升裝入冷凍墨盒。在未經處理的96孔板(Thermo Fisher Scientific)中，使用BIO X(CELLINK，SKU#0000000 2222)上的液滴打印功能對微型肝臟進行生物打印。使用設置為8°C的溫控打印頭(TCPH，SKU#0000000 20346)將膠原液滴分配到設置為8°C–10°C的冷卻打印床上。在第一輪液滴打印后，樣品在37°C下培養3分鐘，然后返回BIO X，使用相同參數進行第二輪液滴打印。在37°C條件下，將得到的封裝液滴熱交聯20分鐘，并為每個孔提供200微升混合培養基（25%IMDM+25%DMEM+50%MEM）。培養液每2-3天更新一次。
 

藥物處理和分析

培養7天后，用不同濃度的APAP[0.1,0.5,1,5,10,25,50 mM]（Abcam）或FLU[10,25,50,75,100,150,200μM]（Selleckchem）處理微型肝臟72小時。采用比色溴甲酚綠（BCG）測定法（Sigma-Aldrich）、ALT活性測定法（BioVision）和活/死染色試劑盒（Invitrogen）分別檢測白蛋白產生、肝損傷和細胞活力。所有分析均按照制造商的說明進行。
 

 結論 

膠原I中的細胞生長和球體形成

膠原I中的細胞生長和球體形成在這項研究中，我們評估了Coll I bioink中的細胞生長、球體形成和遷移模式。到第2天，HepG2和LX2已緊密組裝成小簇，HUVEC已拉長，形成同心網絡（圖1）。使用膠原蛋白作為支架可以在整個培養過程中進行細胞重組、球體極化和細胞增殖（數據未顯示）。此外，根據圖1，很明顯，細胞在整個培養過程中滲透DILI模型，并可能在內部和外部液滴層之間遷移。
 

生物打印微型肝臟的藥物治療和細胞毒性

第10天的毒性評估結果表明，生物打印微型肝臟對APAP（圖2A）和FLU（圖2B）具有細胞毒性和劑量依賴性反應。這種肝功能下降表現為白蛋白分泌和脂質生成減少，ALT活性上調。同樣明顯的是，基于ALT活性的增加，兩種藥物的毒性劑量都會對細胞活力產生破壞性影響。后者在圖3中尤為明顯，其中活/死圖像表明，在較高濃度的APAP或流感病毒下，細胞活力顯著降低。
 

藥物治療的動態細胞內反應

研究了APAP和FLU如何調節細胞內脂肪含量。肝組織的ORO染色通常用于識別脂肪酸或藥物引起的不同階段纖維化或脂肪變性（Pingitore，2019）。在我們的研究中，經處理的微型肝臟的ORO染色顯示，在高劑量藥物處理的樣本中，脂肪積累最小，而在未經處理或低劑量藥物治療的樣本中，脂肪積累顯著（圖4A）。一種解釋是APAP和FLU與脂質過氧化有關，其中毒性藥物水平引起的氧化應激可能引發脂質降解和膜損傷（Behrends，2019）。圖4B中未處理樣品的詳細觀察提供了液滴模型中液滴的橫截面圖。這張圖片顯示了大量細胞向液滴外殼遷移并產生脂肪，可能表明存在營養和氧氣梯度，并驗證了細胞重組模式和膠原內的球體極化。
 

?  作為2D細胞培養系統、動物研究和芯片實驗室原型的可靠替代品，BIO X可作為中高通量工具，用于制作功能性3D生物打印肝臟模型，實現藥物篩選和分析，并減輕藥物消耗的成本。

?  CELLINK Coll I作為DID模型的支架，為模型提供了一個穩定、可調和高度相容的環境，且具有豐富的肝細胞重排和球體形成的結合位點。

?  基于脂質過氧化、白蛋白分泌減少和ALT活性上調的證據，我們的研究結果表明，DID微型肝臟具有功能性，并且對APAP和FLU具有劑量依賴性和細胞毒性反應。

?  DID模型允許組織層之間的細胞間相互作用，并為研究不同硬度層之間的遷移模式提供了獨特的機會。未來的毒性研究可以采用該模型復制纖維化的各個階段，或研究藥物治療后肝臟組織的再生能力。

參考文獻：

1.Behrends, V., Giske?deg?rd, G. F., Bravo-Santano, N., Letek, M., & Keun, H. C. Acetaminophen cytotoxicity in HepG2 cells isassociated with a decoupling of glycolysis from the TCA cycle, loss of NADPH production, and suppression of anabolism. Archivesof Toxicology. 2019; 93(2): 341–353. DOI: 10.1007/s00204-018-2371-0.

2.Chen, M., Suzuki, A., Borlak, J., Andrade, R. J., & Lucena, M. I. Drug-induced liver injury: Interactions between drug properties andhost factors. Journal of Hepatology. 2015; 63: 503–514. DOI: 10.1016/j.jhep.2015.04.016.

3.Pingitore, P., Sasidharan, K., Ekstrand, M., Prill, S., Lindén, D., & Romeo, S. Human multilineage 3D spheroids as a model of liversteatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 2019; 20(7): 1629.