文章來源：生物藥論 公眾號

一、mRNA療法

mRNA 的結構和作用以及新型脂質遞送方式的最新進展和發現使 mRNA 療法得以進入臨床試驗領域。這些產品的制造相對簡單，消除了與用于基因和細胞治療應用的病毒遞送系統的細胞培養生產相關的許多挑戰，從而可以快速生產用于個性化治療、癌癥治療、蛋白質替代和基因編輯的mRNA。mRNA 疫苗在COVID-19 大流行期間的應用，凸顯了該技術作為疫苗接種平臺的巨大潛力，但將mRNA 成為廣泛的治療工具仍面臨特殊挑戰。免疫刺激副產物可能對長期治療構成障礙，這些應用可能需要考慮不同的生產規模。此外，mRNA制劑的長期儲存也是一大難點。

01

mRNA療法發展

從首次將信使 RNA (mRNA)?遞送到體內模型，到使用可電離脂質作為第一個批準的 siRNA 治療藥物的遞送系統開發脂質納米粒子，數十年的基礎研究匯聚在一起，實現了mRNA疫苗及可行的治療方法。鑒于在 COVID-19大流行期間在全球范圍內取得的成功，mRNA 技術平臺目前備受關注，不僅在疫苗方面，而且在癌癥等多種疾病治療方面都顯示出巨大的潛力。作為一種具有廣泛應用的藥物，有可能徹底改變治療領域。

mRNA技術依賴于將編碼抗原或感興趣的治療蛋白的mRNA轉移到細胞質中。這種遺傳信息一旦被翻譯，就會起到刺激免疫反應或改變疾病狀態的作用。與 DNA 療法相反，mRNA 不需要進入細胞核，因為表達直接發生在細胞質中。此外，這消除了與病毒載體和質粒 DNA 技術相關的基因插入風險。并且通過無細胞系統的制造消除了與傳統基于病毒載體基因和細胞療法相關的時間限制和可能的污染物。此外，新的 mRNA 產品意味著新的序列，但 mRNA 的理化特性保持不變，這意味著生產工藝的變化不大，從而形成強大的即插即用平臺。該技術的多功能性使其具有廣泛的治療應用潛力，包括但不限于細胞重編程、基因編輯、蛋白質替代療法和癌癥免疫療法。

▲圖片源自ASGCT Q1 2023 Quarterly Data Report

從歷史上看，基于RNA的基因和細胞療法的進展一直受到與RNA不穩定性、對RNA分子的免疫原性反應以及RNA跨細胞膜遞送相關的挑戰的限制。然而，為了提高穩定性并減少 RNA 分子的降解，已經進行了一些改進，包括堿基修飾和脂質納米顆粒?(LNP)?的出現，作為一種用于傳遞基于 RNA 的治療的先進工具 。其中一系列藥物已進入臨床前和臨床階段，美國基因和細胞治療協會(ASGCT)報告稱，截至?2023?年?4?月，有?897?種?RNA?療法處于臨床研發階段。此外，提及 mRNA 療法的出版物數量在過去十年中一直在穩步增加，表明該領域的發展，如下圖所示。

▲截至 2023 年 8 月，過去二十年每年提及 mRNA 療法的出版物數量

盡管該技術具有潛力，但?mRNA 療法并未像疫苗那樣迅速席卷市場，這主要是由于全球突發衛生事件期間監管流程不同。展望未來，與疫苗相比，mRNA 療法將面臨制造和監管方面不同的挑戰。mRNA 療法的應用、分類和生產方案的多樣性使得簡化監管審批變得更加困難。此外，在生產過程中必須嚴格控制dsRNA等免疫刺激副產物，以確保藥物對長期mRNA治療的免疫耐受性。

在臨床應用中，普遍認為，mRNA原液的dsRNA含量應保持在0.5%以下。日前，西班牙 Certest Biotec公司團隊發表題為“Purification of linearized template plasmid DNA decreases double-stranded RNA formation during IVT reaction”的研究論文，首次證實，提升線性化質粒模板的質量會顯著降低IVT反應中的dsRNA含量。

目前，這些療法在已發表的文獻和專利范圍內缺乏標準化的生產流程，并且制造受到與IVT所需的cGMP級試劑高成本的限制。重復給藥的長期治療需要具有穩定產量和質量，并且價格合適的藥物。

02

mRNA的治療應用

在基因和細胞治療的背景下，mRNA可用于替代或補充疾病基因和蛋白質。具體來說，mRNA 作為單基因疾病中基因或蛋白質恢復的工具是該領域感興趣的。例如，Ramaswamy 等人進行的一項研究，證明了在小鼠模型中遞送因子 IX 編碼 mRNA 可治療血友病 B 。同樣，An 等人證明了使用編碼人甲基丙二酰輔酶A變位酶的mRNA在小鼠中進行mRNA治療可治療小鼠的甲基丙二酸血癥。還有Zangi 等人探索利用編碼血管內皮生長因子 A 基因的 mRNA 進行心臟組織修復。

此外，mRNA在癌癥治療中的應用具有治療價值。在這些情況下，mRNA 可用于傳遞自殺基因或腫瘤相關抗原 (TAA)。2019 年的一項研究檢查了編碼自殺基因的 mRNA 在結腸癌治療中的用途，發現可以成功縮小小鼠模型中的腫瘤大小。近年來，幾種針對罕見遺傳疾病的 mRNA 療法也已進入臨床研發階段，Moderna 和 Translate Bio 等公司在這一領域已率先布局。

由于mRNA可以快速制造，使得個性化基因療法的發展前景充滿希望。個性化醫療策略考慮每個患者的基因型特征，這將允許生產專門針對癌癥患者、罕見代謝疾病患者和一系列其他病癥的療法。從制造角度來看，由于生產規模是針對個體患者而不是全球人口，這些個性化藥物可能需要比在?COVID-19 大流行期間建立的生產設施更小。以醫院為基礎的 RNA 治療計劃，可以加快基因檢測到小型 cGMP 級材料生產的過程，可以適應這些個性化治療的實施。

mRNA療法另一個活躍的開發領域是替代傳統病毒載體建立的細胞療法。具體而言，嵌合抗原受體（CAR）T 細胞療法一直備受關注。該過程涉及使用 mRNA 將 CAR 遞送至自體細胞，并在修飾后將這些細胞重新輸注給患者。而在TCR-T細胞治療領域，LionTCR（來恩生物）另辟蹊徑，其電轉mRNA表達構建HBV特異性TCR-T療法已獲FDA快速通道認可，臨床結果顯示疾病控制率為60%，緩解持續時間為27.7個月，患者的中位OS為33.1個月。此方法的其他多項臨床試驗，包括?ECI-006、MCY-M11和?Descartes-08，分別針對黑色素瘤、表達間皮素的實體瘤和多發性骨髓瘤。

同樣，體外轉錄?mRNA 在基因編輯技術中的應用在文獻報道和臨床應用中都在增長。這項技術涉及編碼基因組編輯核酸酶的 mRNA，包括ZFN、CRISPR 和TALEN，以及修復 DNA 突變的sgRNA。mRNA 在細胞質中表達編碼的核酸酶，然后與sgRNA 一起進入細胞核。該技術避免了與 DNA 介導的方法相關的挑戰，即在細胞質中表達和翻譯之前將編碼的核酸酶基因傳遞到細胞核。多項臨床試驗已經應用了這種技術，包括賓夕法尼亞大學贊助的一項治療 HIV-1 感染患者的試驗。Intellia Therapeutics 也已經開始了相關臨床試驗中評估這種療法。

▲正在進行的臨床試驗按應用、遞送方法和給藥方法的分布

IV：靜脈注射，IT：瘤內注射，IM：肌內注射，ILES：病灶內注射，SQ：皮下注射，INH：吸入，ID：皮內注射，N/A：其它。

03

正在進行的臨床試驗

目前，有?84 項正在進行的（尚未招募、正在招募和活躍的）試驗評估 mRNA 療法，其中大多數針對癌癥（如上圖）。大多數正在進行的臨床試驗涉及使用脂質納米顆粒或脂質體的 mRNA 療法。在這些基于脂質的 mRNA 療法中，涵蓋多種治療方法，包括蛋白質替代療法、癌癥免疫療法、個性化癌癥疫苗、mRNA 編碼的單克隆抗體抗體和基因編輯（表 1），說明脂質納米顆粒（LNP）技術具有多功能性。

▼表1?截至2023年8月正在進行的臨床試驗中基于脂質載體的mRNA療法

盡管應用范圍廣泛，但正在進行的臨床試驗中大多數基于脂質的 mRNA 療法都是靜脈注射。對于免疫治療應用，與其他給藥方法相比，靜脈內給藥可以產生高抗原水平。然而，與組織特異性遞送相比，全身遞送的優點是需要制造更大的劑量。靜脈給藥需要更大體積的藥物，通常會導致藥物在肝臟中積聚，這可能會限制它們在靶組織中的內化。許多通過 IV 遞送的治療藥物已在毫克范圍內的 mRNA 劑量進行了評估，而腫瘤內遞送的藥物 MEDI1191 則在 0.1-12 μg的mRNA 劑量下進行了評估。另一種靶向給藥方法是吸入，近年來也呈現出治療和疫苗應用的潛力。吸入用脂質納米顆粒產品的霧化和配方的最新進展證明了這類方法的可靠性。然而，目前，用于治療囊性纖維化的蛋白質替代療法?ARCT-032 和 VX-522 是正在進行的試驗中可吸入 mRNA 療法。

此外，當前正在進行的臨床試驗一致說明需要重復給藥，強調了 mRNA 藥物產品提高產量的生產工藝需要。然而，與病毒載體相比，mRNA 的安全性及其與蛋白質療法相比在細胞內產生高水平蛋白質的能力平衡了 mRNA 療法長期給藥的挑戰。

除了基于脂質的遞送系統之外，目前正在進行的幾項臨床試驗正在評估使用?mRNA 脈沖的樹突狀細胞用于癌癥免疫治療（NCT04963413，NCT04911621）?，?mRNA基于T細胞療法（NCT05195294，NCT05302037），以及其他載體，包括外泌體和 VLP。而基于脂質的 mRNA 療法的制造，在前期研究和臨床領域普遍存在。相信隨著臨床的不斷涌現，更多mRNA寬范圍的應用產品會逐漸顯現，普及跟多不同類型疾病的患者。

二、mRNA生產上游工藝

mRNA 是一種帶負電荷的單鏈分子，參與蛋白質合成，由側翼為非翻譯區（5''-UTR 和 3''-UTR）的單鏈ORF以及?5''Cap和?3''polyA尾組成。這些結構在mRNA的功能和穩定性中發揮著重要作用，并且必須納入整個生產過程。還可以通過使用環狀RNA和IRES來設計一種不依賴于帽的RNA翻譯結構。新型mRNA治療藥物的生產過程可分為以下主要步驟：（1）DNA模板序列設計，（2）DNA模板生產和純化，（3）體外轉錄（IVT），（4）mRNA純化，（5）封裝以及運輸和儲存。

▲mRNA 療法的制造流程：(1) DNA 模板序列設計和優化，(2) 使用細菌發酵或合成方法生產和純化 DNA 模板，(3) 通過 IVT 合成 mRNA，(4) mRNA 純化，以及(5)封裝和貯存。

01

DNA模板序列設計

mRNA療法的生產過程始于為后續IVT設計 DNA 模板。用于mRNA合成的轉錄模板可以是質粒DNA (pDNA)、PCR產物或合成雙鏈寡核苷酸的形式。通常，DNA模板應包括以下元素：啟動子序列、目的基因 (GOI)、5'' 和 3'' UTR、poly(A)尾。每個元件都可以進行相應的修改或選擇，以提高 mRNA 的穩定性和翻譯。

啟動子

最常見的是T7啟動子，序列?(5''-TAATACGACTCACTATA-3'')?，在 IVT期間被 T7 RNA 聚合酶識別，目前認為是用于mRNA生產制造的標準聚合酶。如果使用帽類似物 CleanCap?AG，則在AGG啟動子序列的 3''端需要一個額外的A?。如果使用不同的RNA聚合酶，例如T3或SP6，則DNA模板中必須存在相應的啟動子。此外，在質粒DNA構建時，需要使用細菌選擇的抗生素抗性標記序列和用于DNA模板線性化的限制位點，且需考慮該酶切位點是否具有GMP級核酸內切酶。

目的基因（GOI）

在目標基因編碼治療性蛋白的應用中，可以對編碼序列進行優化以降低蛋白質免疫原性并增加蛋白質表達。例如，密碼子優化可以使得翻譯和半衰期增強。據報道，高GC含量會增加 mRNA 穩定性、核糖體關聯，從而提高翻譯效率。優化目的基因（GOI）中的GC含量，并在治療性 mRNA 設計中同時去除尿苷，不僅可以提高延伸率和翻譯效率，還可以改變 RNA 二級結構，從而干擾基因表達。

▲圖片源自pharmaceutics期刊

非翻譯區（UTR）

5''和3''UTR對于所遞送的治療性 mRNA 分子的穩定性和翻譯起始都是不可或缺的，其中β-globin UTR 已廣泛應用于臨床試驗和研究領域。5''UTR的長度、序列元件和二級結構，在翻譯起始中發揮著重要作用，哺乳動物體內5''UTR 的平均長度范圍為約100至200nt。然而，有人提出，20nt左右的較短?5''UTR可最大限度地減少翻譯起始過程，從而最大限度地提高蛋白質表達。此外，應避免5''端附近的高度穩定的二級結構，其會破壞核糖體結合和起始翻譯。根據治療目的，可以通過向 5''UTR 引入額外的序列元件來實現選擇性翻譯。在癌癥治療的背景下，腫瘤內注射mRNA可能需要能夠在低營養限制下翻譯的特殊5''UTR 元件。

3''UTR與5''UTR 類似，包含影響翻譯效率和 mRNA 穩定性的調控元件。人們普遍認為，較短的 3''-UTR 由于 microRNA 結合位點的丟失而增加了mRNA的穩定性，從而避免了mRNA的降解。此外，使用兩個連續的β-globin 3''UTR可顯著提高蛋白質表達水平并延長蛋白質的持久性?？衫酶咄考夹g針對UTR優化和開發，包括新穎的基于細胞的選擇過程，用于識別可增加合成mRNA編碼的蛋白質表達的UTR，以及用于優化的大規模并行功能分析。

▲轉染后24小時A549細胞中熒光素酶表達的測定和不同含 Poly(A)的熒光素酶mRNA的定量分析（參考文獻5）

Poly（A）尾

Poly(A)尾在mRNA翻譯和穩定性中起著關鍵作用，可以保護mRNA免受核酸酶降解。可以通過在轉錄后使用 Poly(A) 聚合酶或 在DNA 模板中帶有Poly(A) 序列將 Poly(A) 尾添加到 mRNA 中。后者是臨床應用的標準做法，一致性較高。將?Poly(A)尾延伸至120 nt 可提高翻譯效率，這說明長度是需要考慮的一個重要方面。此外，Trepotec 等人。證明了使用分段聚（A）尾的好處，帶有6個或單個核苷酸(G/T)間隔120nt的分段Poly(A)?可以避免了細菌復制過程中質粒DNA的重組，而不會損害蛋白質表達和 mRNA 半衰期（如上圖所示）。

02

DNA模板生成

為了在 IVT 中使用，需要線性化和純化的 DNA 模板。盡管有多種制造模板DNA的方法，但目前主流還是使用細菌發酵來獲得質粒DNA。另外還有合成和酶促方法來制造這些模板，包括 PCR。

細菌發酵法

質粒DNA的產生通常通過大腸桿菌( E.coli )的發酵來進行。已報道了幾種不同的 pDNA 菌株，例如 DH5α、DH5、DH10B、DH1、JM108和SCS1-L。其中，由于先前已建立的有效生產放大工藝及臨床應用，DH5α仍然是實驗室和工業實踐中使用的標準菌株。在工業規模上，細菌培養擴增主要遵循三個步驟：接種細菌、搖瓶發酵和大規模生物反應器發酵。為了使用該生產平臺提高?pDNA 產量，可以選擇高產菌株和結合不同的培養基成分和培養策略（例如分批或補料分批模式）。

載體工程也有助于提高產量，如使用基于pUC的質粒和基于R1的質粒。有研究證明與分批模式培養相比，補料分批模式培養可產生更高的質粒體積產量。常見pDNA的產量為100–250 mg/L，而使用標準高拷貝pUC起始質粒和新型控制參數進行補料分批發酵可提高pDNA產量（高達 1500 mg/L）。其中，補料分批模式下發酵DH5α，在分批階段以葡萄糖和甘油作為初始碳源，與類似補料階段但不添加甘油的情況相比，產量翻倍。事實上，甘油因其可以提高pDNA產量，被認為是葡萄糖的補充碳源。最常用的大腸桿菌培養基是以酵母提取物作為氮源的Luria Broth (LB)，另外還有改良的MBL培養基。

合成DNA方法

為了避免通過細菌發酵生產pDNA所涉及的克隆和制備步驟，這些步驟既昂貴又耗時，一些工業生產平臺已經采用了替代的模板生產方法。發酵過程可能需要幾天，有時甚至幾周，并且涉及昂貴的試劑，包括細菌和抗生素。最終產品中生物污染的相關風險也已成為臨床GMP中不可避免的問題。

因此，PCR等合成DNA平臺得以應用，來生產mRNA合成所需的DNA模板，這種基于合成寡核苷酸PCR生產DNA模板的方法，在短短幾個小時之內可擴增至微克級別，使DNA生產到mRNA合成可以快速完成，此類方法應用于用量很小的mRNA療法再合適不過，比如個性化mRNA腫瘤疫苗的產生。

▲圖片源自Touchlight Genetics官網

此外，還有其他合成DNA生產方法，如上圖，Touchlight Genetics公司使用體外雙酶工藝開發了一個合成DNA制造平臺。這種專有的酶平臺可在數周內生產出數克DNA，從而實現快速、大規模生產。然而，盡管合成 DNA 模板生產具有潛力，但這些方法尚不能合成更長的DNA鏈。不僅要考慮產量，還要考慮錯誤率，應避免序列中的突變，這一點至關重要。為了生產用于治療應用的mRNA，DNA模板有時需要幾千個堿基長，因此細菌發酵目前仍然最適合的生產方法，預計短時間內很難被取代。

DNA模板純化

為了用于后續IVT反應，DNA模板必須進行純化和線性化，以確保隨后產生的mRNA的質量。在細菌發酵的情況下，純化過程最關鍵且最復雜。從細菌細胞中純化pDNA通常從收獲后的堿裂解步驟開始，其中使用十二烷基硫酸鈉(SDS)和NaOH等溶液最常見。接下來，在澄清之前中和裂解物。然而，由于所得沉淀物的粘性，其成分的分離只能通過預過濾或離心，然后進行澄清過濾，這個過程既耗時又昂貴。此外，由于DNA對剪切應力的敏感性，還需要以低剪切應力技術來溫和地混合細菌裂解物和中和劑，例如?PlasmidFactory 的專利中描述的基于浮選的方法。另外一種 pDNA 純化方法是煮沸裂解，該方法已通過連續熱裂解提取質粒DNA的簡化方法成功大規模使用。

▲圖片源自網絡

在許多傳統的質粒DNA純化過程中，首先使用RNAse酶降解RNA，然后再進行pDNA層析分離步驟。然而，RNAse A是從牛胰臟中純化出來的，其外源性在大規模生產中受到關注。因此，應盡量避免添加RNAse。

為此，提出了無RNAse的純化方法，使用氯化鈣沉淀，然后進行切向流過濾（TFF），分別去除高分子量 RNA 和低分子量 RNA。這兩個步驟也有助于減少微生物蛋白質和宿主DNA，并且可以濃縮產物。此外，在色譜分析之前進行濃縮可以減少柱上樣時間，從而加速整個過程。

純化過程中，基于不同原理的層析步驟可分離不含宿主DNA、RNA、蛋白質和內毒素的高純度質粒，包括分子排阻層析、親和層析、離子交換層析和疏水層析。質?？梢砸远喾N亞型收集：超螺旋圓形亞型、開放圓形和線性，超螺旋是其中最穩定的類型，不同的層析方法組合可以優化整個純化工藝，得到高純度的超螺旋pDNA。

DNA模版線性化

DNA 模板必須線性化，為mRNA轉錄做好準備。在IVT反應中，對于SP6 和 T7 RNA 聚合酶，?5'' 懸垂（overhang）更適合確保聚合酶的穩定性并增強轉錄效率。為了在線性化后實現這種5’懸垂，可以使用核酸內切酶，例如 HindIII、SpeI、SapI、NotI、EcoRI等?。

線性化的DNA模板需要去除酶以及非線性化的 DNA，從而分離純化得到線性化DNA模板用于IVT反應。在實驗室和工業規模的生產中，苯酚氯仿萃取已成為該步驟的標準技術。然而，由于苯酚和氯仿存在一定危險性，已不再是大規模臨床操作的首選。因此，使用帶正電荷的樹脂進行強陰離子交換色譜的方法由然而生，該方法得到的mRNA質量與苯酚氯仿提取相當。隨后利用TFF去除較小的雜質，同時將DNA模板置換到適當的溶劑中進行后續的IVT mRNA生產。

03

mRNA合成

IVT酶法合成

mRNA通過IVT產生，模擬體內轉錄過程，是一個相對快速且簡單的過程，其中RNA聚合酶消耗 NTP來催化從相應的DNA線性模板合成mRNA。所需的成分包括RNA聚合酶、NTP、鎂 (MgCl 2) 和反應緩沖液。常見使用各種噬菌體聚合酶，例如 T7、T3 或 SP6 RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)是研究和生產中最常用的RNAP，因其能夠高保真的生成全長RNA轉錄本（超過 20 kb）。

盡管T7 RNAP 對非天然 NTP 的摻入具有高保真度和耐受性，但它也會產生免疫刺激副產物，例如dsRNA，這可能會影響蛋白質表達并使下游純化過程變得更加困難。dsRNA分子是先天免疫反應激活劑，因此在治療應用中應避免其產生，這是因為臨床治療當中的免疫耐受性極為重要。

可以通過使用計算、結構和實驗室篩選方法設計突變型T7 RNAP，減少dsRNA 副產物的產生。例如，雙突變 T7 RNAP (G47A + 884G)成功降低了dsRNA含量，同時保持了RNA產量和純度。其他包括熱穩定性RNA聚合酶的開發，例如 BioLabs 的 Hi-T7 RNA聚合酶M0658，該酶經過工程設計，可以承受高溫下進行的IVT，防止環回轉錄。然而，一些專家指出，高溫（≥48°C）難以擴大規模，并可能導致RNA降解。

另外，在IVT 期間添加濃度為1 M的尿素被證明是減少導致?dsRNA 形成的不需要的核堿基配對的有效方法。此外，在上一期內容中我們也提到，提高DNA模板的質量也可降低dsRNA的產生。

鎂離子是?T7 聚合酶的輔助因子，而當游離Mg 2+低于5 mM時，轉錄率和IVT效率均大大降低，目前對于游離Mg 2+濃度的理想條件缺乏共識。Sartorius等人研究聲稱每個反應 12–20 mM MgCl 2會增加 mRNA 產量，但 Young 等人聲稱游離 Mg 2+的理想范圍為 50 至 60 mM 。乙酸鎂和氯化鎂均可用于IVT反應。有研究表明，在IVT中時，醋酸鎂優于氯化鎂，并且得到證實。

2023年諾貝爾醫學獎頒給了匈牙利科學家卡塔林·卡里科（Katalin Karikó）和美國科學家德魯·韋斯曼（Drew Weissman），因為他們兩位發現了使用修飾的NTP（例如 N1-甲基假尿苷 (m1ψ)）可以降低合成mRNA的免疫原性并驅動高水平的蛋白質產生，這歸因于減弱了?TLR3 激活的能力。其他修飾核苷酸的摻入，如假尿苷 (ψ)、5-甲基胞苷 (m5C)、N6-甲基腺苷 (m6A)、5-甲基尿苷 (m5U) 或 2-硫尿苷 (s2U) 也使得免疫刺激作用降低。減少免疫刺激和增加mRNA分子的穩定性在mRNA治療和蛋白質替代治療中尤為重要。

有人提出向反應混合物中添加亞精胺可以增強轉錄，而較高濃度下又具有抑制作用。隨后通過實驗設計?(DoE)，發現亞精胺在濃度為0.2至 2 mM時可增強轉錄，進一步支持其用途。

成熟的mRNA需要5''Cap結構來保證mRNA穩定性和基因表達。Cap 1(m 7 GpppN 1 mp) 結構是實現最佳mRNA穩定性和表達的首選結構，因為它被免疫系統識別為自身結構。另一方面，Cap 0(m 7 GpppNp) 可以激活先天免疫反應，損害穩定性和表達水平。有兩種主要的加帽方法：(i）?轉錄后單獨加帽???(ii) 共轉錄加帽，僅一步過程，將 Cap 類似物摻入IVT反應當中。

痘苗病毒加帽酶?(VCE) 通常用于酶加帽并產生 Cap 0結構,使用2''-O-甲基轉移酶(2''-O-MTase)的附加步驟將Cap 0修飾為Cap 1結構，高達100%的加帽效率。Moderna在其針對SARS-CoV-2的mRNA-1273 疫苗中采用了這種后加帽策略。然而，值得注意的是，添加幾個酶促步驟，包括步驟之間增加的純化和緩沖液交換，會使該過程變得復雜且難以把控。

共轉錄加帽可以減少生產步驟，然而Cap類似物的早期迭代存在mRNA反向延伸的風險，從而降低翻譯效率。為了避免這種情況，出現了抗反向帽類似物（ARCA）。然而，它只能用于生成具有Cap 0結構和較低的加帽效率?(60–80%)。后來，Clean Cap 帽類似物的出現徹底改變了該領域，因為這種帽類似物可以高效的共轉錄添加天然存在的Cap 1結構（90-99%），Pfizer -BioNTech的BNT162b2疫苗中就使用了這種帽類似物。與酶法加帽相比，加帽類似物可以更簡單、更快速的生產，但由于專利授權問題可能會帶來很高的成本，得失之間，應分析考量其中的利差關系。

IVT反應可以以分批和補料分批模式進行。補料分批需要在反應過程中添加NTP和Mg 2+，這些組分對反應速率和產率影響最大。補料分批IVT已應用于較大的mRNA分子，可以提高產量。NTP的消耗可以在整個反應過程中使用HPLC進行監測，并相應地補充。極低和極高的NTP濃度都會限制 mRNA 的生產，因此需要研究在整個生產過程中控制NTP水平的方法。通常分批生產的產量為5 g/L，而補料分批可以實現mRNA產量高達12 g/L，這說明此類工藝研究有非同尋常的潛力。

mRNA的自動化生產

盡管以連續模式生產mRNA療法尚未實現，但有人已經探討了這一觀點。通過連續的方式整合生產和純化來優化mRNA制造，可以減少過程中的保存時間和凍融周期，從而有可能提高最終產品的質量和產量。這可以解決大量低免疫原性mRNA制劑重復給藥的需求。自擴增RNA (saRNA)可以以較低的劑量即可達到與傳統mRNA相同的蛋白質表達水平，是一種減少制造和成本負擔的方式。而saRNA 可能存在免疫原性，使其不適合長期給藥的治療。

連續流程需要在整個生產過程中嚴格把控，驗證產品質量并促進其自動化。明確的流程模型對于向連續自動化生產的過渡至關重要。為此，有學者建立了在塞流和連續攪拌反應器中連續生產mRNA的計算機模型，并確定與連續攪拌反應器中的批量生產相比之前，產率的理論改進系數為56倍。還建議使用控制回路，例如比例積分微分（PID）控制，可能是提高生產率、穩健性和遵守關鍵質量屬性（CQA）的關鍵。未來，在mRNA療法的連續端到端制造中進行數字設計和概念設計，為未來的實驗工作建立初始框架，以建立在這些初始方法的基礎上。

化學法固相合成

化學合成方法最初由 Merrifield 于 1963 年建立，用于生產肽，隨后化學合成方法適用于短寡核苷酸的生產，并由 Beaucage 和 Caruthers 改進。一旦擴大到工業規模，這種方法就可以生產公斤級的寡核苷酸，并且可以完全自動化。該方法依賴于亞磷酰胺化學，涉及在固體支持物上以序列特異性方式循環添加核苷。

然而，這種 RNA 生產方法僅適用于短寡聚物，目前使用這種方法最多可能延伸約100-150 nt。這使得該方法目前不適合mRNA生產，但它適合生產siRNA、miRNA 和反義寡核苷酸 (ASO) 分子。通過合成兩條單獨的鏈并通過連接酶（即 T4 連接酶）將它們連接在一起，可以形成更長的RNA分子，但這尚未達到mRNA 酶促合成的效率和生產力。

三、mRNA生產下游工藝

在mRNA制劑生產步驟，除了上一期我們介紹的DNA模板以及體外轉錄部分外，下游mRNA純化，遞送及制備也同樣非常重要。在IVT生產出來之后，需要進行層層純化去除其中的雜質，這有助于確保最終mRNA制劑的純度及安全性。得到純度較高的mRNA后，還需要將其封裝成制劑產品，用于臨床應用。這需要考慮封裝制劑的形式，因為其對于最終mRNA能否成功體內遞送并轉錄發揮療效非常關鍵。

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mRNA純化

從IVT反應產物中分離完整的 mRNA 轉錄本對于產品質量和監管考慮至關重要。相關的雜質包括殘留試劑（DNA 模板、酶、NTP）和副產品（免疫原性dsRNA和轉錄截短mRNA）。DNA、RNA（每kb約300 kDa ）和T7聚合酶（99 kDa）是分子量較大的成分，而NTP和帽類似物則小得多（小于1 kDa），DNA模板通常大于產生的mRNA，因為線性化質粒包含非轉錄的骨架序列。mRNA的純化對于確保免疫耐受以及獲得具有生物活性和治療應用的mRNA至關重要。

題外：小干擾RNA （siRNA）約14 kDa；反義寡核苷酸（ASO）約4–10 kDa

▲RNA制劑開發流程圖

純化開始之前通常先利用DNAse I酶消化殘留的DNA模板，然后用EDTA滅活。然而，使用DNAse I可能會導致小DNA模板片段與最終mRNA產物雜交。因此，也可以采用層析捕獲方法去除DNA模板，避免DNAse I酶消化帶來的產物堿基互作影響?？梢岳肙ligo-dT填料層析純化，特異性結合完整mRNA轉錄本的PolyA尾，達到捕獲純化mRNA效果。Oligo-dT層析純化可以使mRNA回收率超過90%。然而，Oligo-dT純化可能無法從產物中分離dsRNA，在高dsRNA含量的情況下必須聯合其他層析方法進行精制。其他幾種層析技術也可用于mRNA純化，不同之處在于，層析之前之前通常需要切向流過濾（TFF），而Oligo-dT則可以直接捕獲，簡化過程。

▲Oligo dT結合純化

為了之后臨床應用，IVT產物中去除dsRNA較為關鍵，較低的dsRNA有助于提高翻譯效率并降低免疫原性。可以通過避免反應過程中形成dsRNA來降低后期純化難度，包括添加尿素或使用篩選后的T7 RNAP（上一期中提到的G47A + 884G雙突變T7 RNAP），以及提高上游DNA線性化模板純化工藝。

后期去除dsRNA的標準純化方法是高效液相色譜 (HPLC)，而使用纖維素的簡單方法也可以成功地小規模去除dsRNA。其他方法還有羥基磷灰石層析、核心珠層析（復合樹脂填料，具備分子排阻和結合特性）和陰離子交換層析，綜合各類方法可以提高純化平臺的可擴展性。GSK有一個專利詳細介紹了使用 DNAse、TFF和CaptoCore 樹脂（一種核心珠層析樹脂）的RNA 純化方法，具體過程感興趣朋友可以通過專利號US20210214388A1檢索了解，這種純化方法可能取決于具體mRNA產品，因為這種核心柱層析的mRNA回收效率會根據序列的長度而變化。

▲CaptoCore樹脂結構

總之，已有多種可擴展的層析方法用于mRNA純化，需要進一步努力簡化流程，同時保持產品的高質量。對于大規模mRNA生產，最好避免需要加熱mRNA樣品或使用有機溶劑的方法。在長期給藥的治療方法中，要求工藝必須要確保低水平的免疫刺激副產物，這至關重要。

02

mRNA遞送

裸mRNA注射后，超過90%的RNA在給藥后會很快被機體清除。此外，mRNA分子的大小、負電荷和親水性阻礙了其穿過細胞膜進入細胞質翻譯。為了防止mRNA降解同時進入細胞內翻譯，在很多應用領域中，開發了mRNA治療遞送系統?；谥|和聚合物的mRNA遞送使該技術成功進入臨床領域，其中脂質納米顆粒 (LNP)?最為普遍。因2018年siRNA藥物Onpattro的批準，LNP 首次進入治療領域，又在新冠大流行期間Pfizer/BioNTech和Moderna的疫苗中得以應用。

▲mRNA-LNP制劑組成結構

該載體主要由可電離的陽離子脂質、輔助脂質、聚乙二醇（PEG）脂質和膽固醇組成?？呻婋x的陽離子脂質與mRNA相互作用形成復合物。對于免疫治療應用，研究表明，選擇的可電離脂質的 pKa 值應在 6.6 至 6.9 之間，才能引發適當的免疫反應，輔助脂質（通常是磷脂）和膽固醇用于穩定LNP并幫助mRNA逃逸到內體，PEG脂質可減少LNP的聚集并延長給藥后顆粒的循環時間。mRNA 治療產品中可通過改變脂質摩爾比會影響LNP的大小和zeta電位，從而影響藥物的生物分布和免疫原性。因此應根據應用進行優化，Moderna的一項研究表明，粒徑在60至150 nm之間的LNP可在非人類靈長類動物中產生強烈的免疫反應?。

▲ SORT-LNP技術平臺（ReCode Therapeutics官網）

通過靜脈內和肌肉內注射的LNP制劑會在肝臟中非特異性積聚，這種積累存在一定的副作用。為了減少脫靶效應，將mRNA-LNP制劑定向至靶組織至關重要。Recode公司開發的選擇性器官靶向 (SORT) 納米粒子證明，用特定百分比的帶電脂質作為第五種組分的SORT-LNP，可以改變組織靶向性，另外還可以選擇抗體修飾LNP進行組織靶向。這些技術應用還可以減少用于在特定組織中表達的mRNA治療劑的劑量需求。

03

mRNA-LNP合成

脂質濃度、mRNA 濃度、脂質與mRNA的比率以及封裝技術會影響粒徑、PDI、表面電荷和包封率，這些都是產品的關鍵質量屬性并影響產品的活性。

mRNA-LNP最常使用T型混合和微流控混合來配制，其中Pfizer/BioNTech、三星生物/Moderna的新冠疫苗是采用了碰撞噴射混合技術來生產，設備供應商來自德國KNAUER公司（北京綠綿科技有限公司，中國）。碰撞噴射混合技術（IJM）可用于帶有活性藥物成分（API）的脂質納米顆粒的配方開發及規?；a（例如用于核酸藥物）?；钚运幬锍煞峙c脂質的封裝是在碰撞噴射混合器腔體中進行，兩股料液（水相、有機相）在高流速狀態下進行碰撞混合，高速混合降低了脂質的溶解度，進而形成均一的納米粒，納米粒的質量取決于料液的流速穩定性、碰撞噴射混合器的幾何形狀和流體速度。工藝最后對形成的納米粒進行淬滅，防止顆粒的聚集生長。整套系統全面符合GMP法規要求，配備的CDS軟件簡單易操作，符合21CFR Part11和GAMP5，使用時軟件上所顯示的每個設備都可以手動控制，從而有機會在運行過程中優化工藝配方。系統集成在不銹鋼框架中，滿足制藥生產中的CIP清洗程序要求。

04

mRNA-LNP 制劑及優化

mRNA-LNP的熱穩定性和物理穩定性仍然是mRNA療法推向更廣闊市場應用的一個挑戰。在非流行疾病應用的治療用途情況下，產品在使用前可能需要長期儲存。此外，為了改善治療的可及性和運輸，優選冷藏或室溫儲存，凍干制劑和液體制劑都被認為可以改善mRNA-LNP的儲存。緩沖液和冷凍保存劑的選擇會影響液體和固體制劑中LNP的穩定性，如與Tris和PBS相比，Hepes 緩沖液在凍融后能更好地保持LNP的形態。與儲存在PBS和Hepes中的LNP相比，在Tris緩沖液中的LNP可以改善基因的表達。

▲不同緩沖液對mRNA-LNP遞送的影響（圖片源自Mol. Pharmaceutics）

蔗糖，甘露醇和海藻糖等冷凍保存劑在水性、冷凍和凍干條件下可以改善長期儲存脂質納米顆粒的效果。當儲存在4°C時，顆粒在儲存5個月內會降低大部分的遞送效率。此外，在液氮中冷凍時，蔗糖和海藻糖的遞送效率優于甘露醇。對于包封siRNA的LNP，蔗糖和海藻糖在冷凍過程中保存LNP的效果類似。

此外，制劑也會根據應用和給藥方法而有所不同。例如，對于通過吸入進行肺部輸送，制劑需要霧化。這個過程很容易破壞mRNA-LNP的穩定性，影響大小、包封率和之后的mRNA表達。雖然LNP的脂質成分會影響其在整個霧化過程中的穩定性，但制劑賦形劑也可用于減少整個過程中這些關鍵質量屬性的變化。Moderna的一項專利描述了適合霧化的mRNA-LNP 配方變化，其在Tris緩沖液中加入 P188 和蔗糖，配方還能夠在高達19次凍融循環過程中保持形態和包封率（US20200069599A1）。

凍干有望在室溫下儲存mRNA-LNP制劑，而不受水解影響。有研究表明，在Tris的緩沖液中添加 20% 蔗糖 ( w / v ) 可以成功凍干，而不會對LNP大小、zeta電位或體外表達產生重大影響。此外，在蔗糖 (10% w / v ) 和麥芽糖 (10% w / v ) 存在下凍干mRNA-LNP可使制劑在室溫和4°下的至少穩定12周。這說明在基于脂質的mRNA制劑整個生產過程中評估冷凍保護劑和脂保護劑的必要性。

結語

mRNA這種新型療法的制造和商業化仍面臨諸多挑戰，具體如，多樣化應用藥物模式的監管框架仍不完善，進一步簡化審批流程可以加速新的mRNA產品商業化。隨著mRNA療法的應用和臨床試驗數量的增加，監管機構需要協調以便為這些產品制造建立必要的要求和控制。

與疫苗相比，一般治療制劑具有不同的劑量要求，因此需要制定不同的生產規模。注重工藝優化迭代升級，特別是自動化和嚴格控制的連續制造，可以提高產量和改善產品質量，降低免疫刺激副產物（如dsRNA）含量，并減少對昂貴的GMP級試劑設備的依賴。另外，在非流行疾病應用中，還需要開發適合長期儲存mRNA的制劑。總體而言，隨著生產方法不斷完善，行業中mRNA制造的標準化可以促進監管部門的批準并提高產品產量和一致性。

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