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PROTAC藥物代謝物研究 | SCIEX 7600 系統準確鑒定GNE-987氧化代謝產物位點

SCIEX

2023.8.23

蛋白水解靶向嵌合體（Proteolysis-Targeting Chimera, PROTAC）是一種雜合雙功能小分子化合物，結構中含有兩種不同配體，一個是泛素連接酶 E3 配體，另一個是與細胞中目標靶蛋白結合的配體，兩個配體之間通過 Linker 相連，從而形成“三體”聚合物——靶蛋白配體-Linker-E3 配體。然后通過 E3 連接酶給靶蛋白加上泛素化標簽，啟動細胞內強大的泛素化水解過程，通過泛素-蛋白酶體途徑特異性地降解靶蛋白，因其擴展了可成藥靶點的覆蓋范圍，并有潛力解決小分子抑制劑的耐藥性問題，因此在生物醫藥領域的學術界、產業界和投資界均引起了廣泛關注[1]。GNE-987是一種降解溴結構域蛋白4 （BRD4）的PROTAC，由VHL配體、BRD4配體與間隔基團組成，具有皮摩爾級別的BRD4降解活性，所以這也給它的安全性和活性評價帶來了一定難度。

PROTAC藥物的安全性挑戰主要涉及脫靶蛋白降解、與傳統小分子藥物在藥物動力學/藥效學（PK/PD）上的差異，以及在非臨床試驗中選擇合適的種屬進行安全性評估[2]。通過體外代謝產物鑒定研究，可以幫助識別PROTAC的代謝位點，以指導PROTAC的結構優化得到更具代謝穩定性的化合物。肝微粒體體外溫敷法較其他的體外肝代謝方法而言，其酶制備技術簡單，代謝過程快，結果重現性好，易大量操作，便于積累代謝樣品用于結構鑒定；同時，該方法可以用于對酶的抑制和誘導、體外代謝清除和藥物相互作用的研究，因而在實際工作中應用較為廣泛，是研究體外代謝的常用方法之一。

藥物代謝產物的結構鑒定是藥物代謝研究的核心與難點，PROTAC分子因其結構的復雜性使得其代謝產物鑒定的工作面臨較大的挑戰。質譜分析在藥物代謝研究領域發展十分迅速，尤其是高分辨率質譜以其高分辨率和突出的定性分析能力等優勢逐漸成為研究藥物代謝產物及代謝轉化途徑的強有力工具。SCIEX高分辨質譜 ZenoTOF? 7600 系統既含有根據化學鍵鍵能強弱產生二級質譜碎片的CID模式，又含有基于低能電子和帶電離子相互作用，從而產生更加豐富碎片的EAD模式，可以為藥物代謝產物位點的確認帶來巨大的幫助。

將GNE-987與人肝微粒體共同孵育后，樣品中出現m/z 1128.45的離子，根據其精確一級質荷比和[M+H]+的CID二級質譜碎片信息（如圖1），推測其為GNE-987的雙氧化產物。另外， m/z 431.21、m/z 483.09和m/z 811.33的二級質譜碎片，經過歸屬，可推測氧化發生在Linker的脂肪鏈上，但具體位點無法確定。在其[M+Na]+的EAD二級譜圖中（如圖2），出現一系列丟失-CH2所產生的質譜碎片，另外m/z 567.22→m/z 551.23和m/z 523.19→m/z 507.20，提示在這兩個位點分別丟失-O，即氧化發生位點。

圖1. 雙氧化產物的[M+H]+ CID二級質譜圖

圖2. 雙氧化產物的[M+Na]+ EAD二級質譜圖

SCIEX ZenoTOF? 7600 系統既具備常規CID模式，又含有特殊的EAD模式，在本實驗中，對PROTAC藥物GNE-987的氧化代謝產物的代謝位點確認中起到了信息補充的作用，為代謝產物結構的準確鑒定提供了理論依據。

SCIEX ZenoTOF? 7600 高分辨質譜系統中含有的Zeno??阱，可以對低豐度的代謝產物二級質譜碎片進行富集，從而提高其二級質譜圖的質量。

數據處理中采用SCIEX OS 軟件和Molecule Profiler 軟件搭配使用，可以快速將可能的代謝物在原始數據中進行精準定位并推導結構，使藥物代謝物鑒定的工作流程更加高效、流暢。

參考文獻

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1. Louise M. Sternicki, Jim Nonomiya, Miaomiao Liu, et al. Native Mass Spectrometry for the Study of PROTAC GNE-987-Containing Ternary Complexes [J]. Chem Med Chem, 2021, 16, 1-6.

2. Jones, L. H.; Mitchell, C. A.; Loberg, L.; Pavkovic, M.; Rao, M.; Roberts, R.; Stamp, K.; Volak, L.; Wittwer, M. B.; Pettit, S., Targeted protein degraders: a call for collective action to advance safety assessment. Nat Rev Drug Discov 2022, 21 (6), 401-402.