分享至
Nature | 巨噬細胞富馬酸水合酶抑制線粒體RNA介導的干擾素產生
巨噬細胞的效應功能由代謝重編程支撐，這涉及與生物能量學相關的中央代謝途徑的重新編程，并通過 TLR4 配體脂多糖 (LPS) 的刺激得到促進。這種代謝重編程使巨噬細胞能夠產生細胞因子，這些細胞因子在炎癥中起著關鍵作用。盡管代謝重編程在巨噬細胞活化中很重要，但所涉及的機制尚未完全清楚。愛爾蘭都柏林三一學院的Luke A. J. O’Neill團隊通過多種代謝分析方法發現脂多糖刺激會出現在巨噬細胞中誘導炎癥過程，從而增加細胞溶質富馬酸鹽水平和富馬酸鹽介導的蛋白質琥珀化。抑制延胡索酸水合酶 (FH) 會導致延胡索酸水平升高、線粒體呼吸受到抑制和細胞因子產生發生改變。在系統性紅斑狼瘡患者的細胞中觀察到FH抑制，表明其在人類疾病中具有潛在的致病作用。相關結果發表于Nature。
富馬酸鹽在巨噬細胞中的累積
首先利用無偏代謝組學方法研究炎癥性骨髓源性巨噬細胞 (BMDM) 中急性和長期脂多糖 (LPS) 刺激期間發生的代謝變化，發現LPS刺激后富馬酸鹽水平和富馬酸鹽介導的蛋白質琥珀化增加。據此提出天冬氨酸-精氨基琥珀酸分流可能是富馬酸的來源，因為觀察到天冬氨酸減少和精氨基琥珀酸、富馬酸和蘋果酸水平增加。這也發生在長時間LPS刺激期間。LPS刺激后，精氨基琥珀酸合酶 (Ass1) 的表達增加，而富馬酸水合酶 (FH) 的表達減少。用GOT2抑制劑氨氧乙酸 (AOAA) 抑制天冬氨酸-精氨基琥珀酸分流并敲低Assl可防止富馬酸積累，表明富馬酸的產生依賴于天冬氨酸-精氨基琥珀酸分流。
圖1. LPS刺激通過谷氨酰胺回補和天冬氨酸-精氨琥珀酸分流驅動富馬酸積累
作者使用穩定同位素輔助示蹤代謝流分析來研究富馬酸鹽積累的來源及其與天冬氨酸-精氨琥珀酸鹽分流的關系，發現谷氨酰胺依賴性回補是導致富馬酸積累并驅動天冬氨酸-精氨琥珀酸分流的原因。U-13C5-谷氨酰胺代謝流分析進一步證實谷氨酰胺分解是TCA循環、天冬氨酸-精氨基琥珀酸分流代謝物（包括富馬酸鹽和谷胱甘肽）的碳源。
擴展圖2. LPS刺激通過谷氨酰胺回補和天冬氨酸-精氨琥珀酸分流驅動富馬酸積累
15N2-谷氨酰胺代謝流分析還表明，谷氨酰胺氮是谷胱甘肽合成和天冬氨酸-精氨琥珀酸分流代謝物的來源。
擴展圖3. LPS刺激通過谷氨酰胺回補和天冬氨酸-精氨琥珀酸分流驅動富馬酸鹽積累
AOAA對GOT2的抑制通過其阻止谷氨酰胺氮對天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸和瓜氨酸的貢獻得到證實。代謝組學分析表明，LPS刺激導致胞質溶膠中衣康酸、琥珀酸、精氨基琥珀酸、富馬酸和2SC等代謝物的積累。據此提出假說，不能合成衣康酸的 Irg1–/– BMDMs由于琥珀酸脫氫酶抑制作用的減輕，會表現出更多的天冬氨酸-精氨基琥珀酸旁路代謝物的積累。 Irg1–/– BMDM的代謝組學分析證實了這一假設，顯示衣康酸和琥珀酸水平降低，天冬氨酸-精氨琥珀酸分流代謝物增加，包括富馬酸和一氧化氮，進一步支持了線粒體TCA循環活動與天冬氨酸-精氨琥珀酸分流之間的聯系。
擴展圖4. 胞質溶膠和Irg1–/–巨噬細胞中天冬氨酸-精氨基琥珀酸分流代謝物的增加
FH抑制導致代謝重編程
為了研究TCA循環和相關代謝途徑如何調節巨噬細胞功能。通過藥理學抑制劑和基因敲除模型來操縱巨噬細胞中的FH活性，然后分析由此產生的代謝途徑和細胞功能的變化。結果發現FH抑制導致線粒體生物能量學受損和TCA循環代謝物的改變，包括富馬酸鹽和2SC積累的增加。FH抑制還誘導氧化還原應激反應，如活性氧產生增加和谷胱甘肽水平降低，同時抑制FH會導致吞噬作用受損以及響應LPS刺激而產生促炎細胞因子。這些影響部分由富馬酸鹽的積累介導，富馬酸鹽抑制琥珀酸脫氫酶并導致線粒體呼吸受損和ROS產生。FH抑制還增加了免疫調節代謝物衣康酸鹽的產生，該物質之前已被證明具有抗炎作用。表明FH抑制可能是一種潛在的調節巨噬細胞介導的炎癥的治療策略。
圖2. FH抑制會增加生物能量應激、富馬酸鹽水平和MMP
FHIN1是FH的一種抑制劑，可降低ATP/ADP、ATP/AMP和P-肌酸/肌酸的比率，損害基礎呼吸、ATP 產生和最大呼吸，并導致明顯的代謝變化。用FHIN1處理的細胞中活性氧的產生增加，線粒體膜電位 (MMP) 依賴性染料Mitotracker Red的染色強度增加，烏頭酸鹽/檸檬酸鹽比率降低，這表明富馬酸鹽敏感性和氧化還原敏感的TCA循環酶烏頭酸酶。 此外，FH抑制誘導了大量的氧化還原應激反應，導致總谷胱甘肽耗盡，這與富馬酸鹽介導的谷胱甘肽耗盡一致。
擴展圖5. FH缺失會增加生物能量應激、富馬酸鹽和線粒體膜電位
FH維持適當的細胞因子反應
用FHIN1處理的BMDM進行RNA測序和蛋白質組分析。基因富集分析確定了與新陳代謝相關的基因受到抑制，以及影響炎癥的途徑，例如IL-1和IL-10信號傳導。 發現TNF信號轉導是分析中上調程度最高的通路。比較FHIN1和DMF在細胞因子讀數上的結果表明，兩者都降低了IL-10的釋放和表達，而TNF的釋放和表達增加了。FH調節的IL-10-TNF軸在人體細胞中具有活性。GOT2抑制劑AOAA可減少富馬酸鹽的積累，可分別適度增加和減少IL-10和TNF的釋放。
圖3. 維持適當的細胞因子反應需要FH活性
FHIN1和DMF還降低了IL-1β表達和IL-6釋放。還觀察到增加的氨基酸代謝和運輸以及自噬轉錄物，它們對ERK1/2和PI3K誘導的AP-1信號軸的下調可能會抑制IL-10，但未觀察到上游激酶AKT、JNK、ERK和p38的變化。巨噬細胞中Fh1的缺失導致IL-10表達和釋放減少以及TNF釋放增加，因FH的藥理學或遺傳抑制而加劇，導致富馬酸鹽積累增加。因此，FH的持續表達和活性可以防止富馬酸的過度積累和IL-10 、TNF的失調產生。
擴展圖6. FH抑制重塑炎癥基因表達
與此同時，FH抑制導致巨噬細胞中NRF2和ATF4應激反應的激活以及與炎癥相關的激素GDF15的產生增加。FHIN1和DMF處理導致IL-10表達和釋放減少以及TNF釋放增加。FH抑制增加了線粒體谷胱甘肽進口商SLC25A39的表達。
FH抑制線粒體RNA驅動的IFNβ釋放
I型干擾素 (IFN) 反應，基因的RNA-seq分析顯示FH抑制后對IFN表達和信號傳導的不同影響，Tlr7或dsRNA傳感器Ddx58和Ifih1的沉默消除了用FH抑制觀察到的IFNβ釋放的增加，表明FHIN1驅動的IFN反應對這些傳感器和線粒體RNA而不是線粒體DNA的非冗余需求。在SLE患者中，與來自健康個體的樣本相比，FH表達被顯著抑制，并且已在SLE 患者中檢測到針對dsRNA和dsDNA的自身抗體。
圖4. FH損傷通過線粒體RNA驅動的逆行反應觸發IFNβ釋放
使用改變MMP的化合物，如寡霉素、纈氨霉素和 CCCP，可誘導mtRNA的積累并促進LPS驅動的IFNβ釋放。這些發現表明線粒體損傷和核酸釋放可能在免疫介導的疾病中發揮作用。
LPS誘導的Ddx58和Ifih1的表達表明，在LPS刺激過程中需要RIG-I-MDA5信號傳導，并且LPS后期刺激過程中的Ifnb1轉錄由mtRNA釋放維持。 這些發現表明，線粒體逆行I型IFN反應在晚期LPS激活過程中是內源性活躍的，并且可能對衰老過程中的慢性炎癥有影響。
擴展圖7. 延長的LPS刺激會增加線粒體膜電位和dsRNA
小結
本文發現了導致mtRNA釋放的線粒體逆行信號通路，該通路可能有助于SLE等干擾素病中I型干擾素的釋放。已在SLE患者中發現與線粒體應激相關的FH抑制，并且在SLE患者中檢測到針對dsRNA和dsDNA的自身抗體。結果表明，FH抑制和I型IFN釋放之間可能存在負反饋回路，這可能有助于炎癥驅動的腫瘤發生，并在病毒感染期間作為潛在的宿主防御機制。本文還指出了內源性產生的dsRNA的臨床相關性，并表明靶向該通路可能會導致新的抗炎策略。
參考文獻
Macrophage fumarate hydratase restrains mtRNA-mediated interferon production. Nature. 2023.
