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熱點應用丨小鼠腸道組織切片“全息”成像——拉曼光譜多光子成像
雙光子熒光和二次諧波
雙光子熒光(2PEF)和二次諧波(SHG)是研究生物樣品方面的多光子成像技術。兩種成像技術都利用飛秒脈沖紅外激發光產生較短波長的光來對樣品進行成像，通過不同的物理過程實現（圖1）。在2PEF中，兩個紅外光子同時被熒光團吸收，使其進入激發態，然后輻射弛豫，發射較短波長的熒光。相比之下，SHG不是吸收和發射過程，而是兩個紅外光子結合在具有特定對稱性的非線性光學材料中，產生恰好是入射光子一半波長的新光子。這兩種技術都利用紅外光的較低散射和吸收，來實現深入組織的成像。在本文中，天美愛丁堡儀器公司的RMS1000共焦顯微拉曼光譜儀，使用2PEF和SHG對小鼠腸道的組織切片進行成像。
圖1 雙光子熒光 VS 二次諧波
樣本：使用 Alexa Fluor? 568染色的小鼠腸道組織切片；
RMS1000 配備電動 XYZ 載物臺和 40x NA = 0.75 物鏡；
對于光學成像，RMS1000 配備了背照式CCD相機（可用于壽命成像）；以及，光子計數混合光電檢測器和時間相關單光子計數 (TCSPC)器。2PEF 和 SHG 都需要非常高的激發強度，可使用鎖模飛秒脈沖激光器實現的。RMS1000具有外部激光器耦合端口，可將飛秒激光器耦合到顯微鏡光路中。
2PEF和SHG的CCD相機光譜成像
使用RMS1000的CCD相機對小腸組織切片進行光譜成像。
樣品的面積為900μm×800μm，空間分辨率為2μm。樣品在1040nm、80MHz的頻率下被激發，用CCD相機同時獲得2PEF和SHG信號。多光子成像如圖2a所示。Alexa Fluor?568染料在630 nm處的2PEF成像顯示為藍綠色，顯示出腸絨毛的結構。粉色顯示的區域是腸壁附近的纖維膠原蛋白，在520nm處的SHG信號。SHG只發生在非中心對稱的分子結構中，纖維膠原蛋白是一種常見的具有這種生物結構的物質，可以引起強烈的SHG信號響應。圖像中的每個點都有對應的光譜信號，A點和B點的光譜，如圖2b所示。在A點，只有來自Alexa Fluor?568染料的2PEF信號，一個寬的發射峰在630 nm處，而在B點有另一個520nm的尖峰，這是SHG信號。通過分別繪制2PEF和SHG在630 nm和520 nm處的光譜強度，得到了圖2a中的彩色圖像。
圖2 （a）用Alexa Fluor?568染色的小鼠腸道切片的2PEF和SHG圖像
（b）從圖像中選取兩點的光譜圖
混合光電檢測器的2PEF壽命成像
通過雙光子熒光壽命成像可以獲得更多的信息。對于壽命成像，使用脈沖選擇器將激光的頻率降低到20 MHz，以確保脈沖之間的完全熒光衰減。利用光子計數混合光電檢測器上的TCSPC，采樣相同的900μm x 800μm區域，并記錄了每個點的熒光衰減。使用RMS1000 Ramacle?軟件對每個熒光衰減進行指數模型擬合，得到的壽命圖像如圖3a所示。壽命圖像顯示，與絨毛相比，腸壁附近的腸隱窩的熒光壽命降低；這是一個可以從壽命成像中獲得更多樣本信息的例子。
圖3 （a）用Alexa Fluor?568染色的小鼠腸切片的2PEF壽命圖像
（b）從圖像中選取兩點的熒光衰減
結論
采用RMS1000共聚焦顯微拉曼光譜儀的多光子顯微成像技術，可以對小鼠腸道切片樣本進行成像。RMS1000配備一個外部飛秒激光器和TCSPC，用于先進的光譜和時間分辨的多光子成像技術，如2PEF和SHG，增強了拉曼成像的核心能力。
愛丁堡共聚焦顯微拉曼光譜儀
RMS1000
愛丁堡RMS1000是一款科研級、模塊化共聚焦顯微拉曼光譜儀，可以實現超高的光譜分辨率、空間分辨率和靈敏度。RMS1000的設計基于強大的專業知識和經典光路原理構型，結合現代光學設計，注重功能、精度和速度，在模塊化和擴展性上形成獨具一格的現代化顯微拉曼光譜儀。RMS1000可以配置多達5個集成的窄帶激光器，擴展外部激光器，可以實現拉曼成像、雙光子成像、二次諧波成像、熒光壽命成像等功能，獲得樣品的全方位信息，適用于生物、組織切片類樣品的無損、深層次分析。
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